CRISPR-Cas12a辅助RPA的辣椒曲叶病毒即时检测平台：荧光与比色双读数的开发与应用

《Frontiers in Microbiology》：RPA-assisted CRISPR-Cas12a-enabled point-of-care diagnostic platform for chili leaf curl virus with fluorescent and colorimetric readouts

本文开发了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a系统（DETECTR）相结合的现场快速诊断平台，用于辣椒曲叶病毒（ChiLCV）的高灵敏、高特异性检测。该技术通过优化crRNA设计及反应条件，实现了对病毒AC1基因的靶向识别，并利用荧光读数或侧向层析试纸条（LFA）进行结果可视化，检测限低至7飞克，媲美实时荧光定量PCR（qPCR），且可直接用于病叶粗提液，具备突出的田间应用潜力，为辣椒病毒病的及时防控提供了实用工具。

　　

引言

辣椒（Capsicum annuum）是印度重要的经济作物，年产量达270万吨，占全球产量的25%。然而，气候变化和害虫再兴导致烟粉虱传播的双生病毒（Begomovirus）引起的辣椒曲叶病日益严重，造成叶片上卷、皱缩及植株矮化，发病早时可导致85%-100%的产量损失，严重威胁农民生计。在印度次大陆，该病主要由辣椒曲叶病毒（ChiLCV，Begomovirus chillicapsici）引起，其基因组为单组分或双组分环状单链DNA，常伴随β卫星分子。此外，蓟马和螨虫为害也可导致叶片变形，易与病毒症状混淆，常引发误诊和不当防治，增加生产成本。

传统ChiLCV检测方法包括PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）和局域表面等离子体共振（LSPR）等，其中qPCR是金标准方法，灵敏度达约0.15 fg病毒DNA，但依赖精密仪器、专业操作和较长检测时间，限制其田间应用。近年来，基于CRISPR-Cas系统的诊断技术崭露头角，特别是DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统（DETECTR），利用Cas12a在引导RNA（crRNA）介导下靶向切割双链DNA后非特异性切割单链DNA报告分子的特性，结合RPA或LAMP等温扩增技术，已成功用于多种植物病毒的检测。

本研究旨在开发一种RPA辅助的CRISPR-Cas12a DETECTR系统，通过荧光或LFA读值实现ChiLCV的快速、高灵敏、高特异性检测，以满足田间即时诊断需求。

材料与方法

病毒构建体、植物基因型及接种方法：研究使用基于ChiLCV马哈拉施特拉分离物（MK882926）的部分串联重复农杆菌构建体（PTR），通过农杆菌浸染易感辣椒品种“Pusa Jwala”的幼苗（3-4叶期），并在受控环境（24±2°C，70%相对湿度）下培养。克隆的ChiLCV DNA用于方法标准化及灵敏度、特异性评估，田间验证样本采集自印度主要辣椒种植区（新德里、特伦甘纳、安得拉邦、卡纳塔克邦和西孟加拉邦），包括 symptomatic 和 asymptomatic 叶片，以及疑似螨虫或蓟马为害样本，每地点10份。

crRNA设计：从NCBI获取ChiLCV及其他双生病毒序列，针对ChiLCV所有印度分离株中高度保守的AC1基因区域，利用BioEdit软件进行多序列比对，通过EuPaGDT网络工具预测crRNA靶点，并评估其脱靶效应（针对辣椒基因组）、自由能和GC含量，利用RNAfold服务器分析二级结构，最终筛选出特异性高、稳定性好的crRNA序列（5′-TTTCTCCTTTTTGTTCTTCTTCTTT-3′），由IDT公司合成。

crRNA评估：通过体外切割实验验证crRNA效率，将ChiLCV基因组DNA与crRNA、LbaCas12a以1:10:10摩尔比在37°C孵育30分钟，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测切割效果；加入DNase Alert荧光报告分子，紫外下观察荧光以评估检测能力；以6种近缘双生病毒（ToLCNDV、ToLPalV、ToLCJoV、ToLCGuV、ToLCBV、ToLCKV）的克隆DNA为模板进行特异性测试；利用克隆病毒DNA、病株总DNA（CTAB法提取）及病叶粗提液（1X TE缓冲液制备）评估CRISPR-Cas12a系统的灵敏度。

RPA评估：针对ChiLCV AC1基因设计RPA引物（FP2/RP7），扩增约520 bp片段包含crRNA靶序列；使用TwistAmp Basic试剂盒，在32-39°C及5-25分钟范围内优化反应条件；以系列稀释的克隆DNA（0.3 ng-30 ag）、总DNA（100 ng-1 fg）及粗提液（10倍稀释至10^–5）测试灵敏度，并与常规PCR（退火58°C，35循环）对比；以6种近缘病毒DNA测试RPA特异性。

RPA辅助CRISPR-Cas12a荧光检测：取1 μl RPA产物与CRISPR-Cas12a-DNase Alert复合物37°C孵育15-20分钟，紫外下观察荧光，以健康植株DNA为阴性对照。

RPA辅助CRISPR-Cas12a LFA检测：使用HybriDetect-1试纸条及5′-FAM-TTATT-3′-Biotin报告分子；试纸条含链霉亲和素控制线（C线）和抗FAM抗体测试线（T线），样品垫包被金纳米颗粒标记的抗FAM抗体；通过优化报告分子浓度（5 pM-500 nM）及孵育时间（5-30分钟），确定最佳条件；以系列稀释克隆DNA（70 ng-7 fg）测试灵敏度，以近缘病毒DNA测试特异性；利用ImageJ软件计算T/C比值（测试线/控制线相对强度），并进行Logistic阈值建模（四参数Logistic函数）分析系统响应。

统计分析：采用受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断性能，使用R软件（v4.3.1）进行卡方检验比较多地数据，所有实验重复三次。

成本分析：对比传统PCR、SYBR Green qPCR、探针qPCR及DETECTR（基于粗提液）的成本，包括核酸制备、扩增试剂、CRISPR组分、检测读值、引物/探针、耗材、人工（按24样本批次计）、管理费（耗材15%）及设备折旧（5年寿命，年通量3000样本），按2024年印度市价估算（1 USD=88.08 INR），给出各平台每样本近似成本。

结果

crRNA-Cas12a单独可有效检测克隆质粒但无法检测DNA或粗提液：从9个候选crRNA中筛选出1个（靶序列5′-TTTCTCCTTTTTGTTCTTCTTCTTT-3′）在ChiLCV分离株中高度保守，二级结构无发夹，且与近缘病毒对应区域存在序列差异，特异性高。该crRNA与Cas12a可将克隆病毒基因组（~2.7 kb）切割为~1.8 kb和~0.9 kb片段，荧光检测中仅ChiLCV克隆DNA产生信号，但对病株总DNA和粗提液检测能力有限，表明单独CRISPR系统灵敏度不足。

RPA单独高灵敏但非特异性检测ChiLCV：RPA在35-39°C、10分钟内可检出总DNA和粗提液中病毒；对克隆DNA灵敏度达0.03 fg（约1000病毒拷贝），对总DNA阈值为10 pg（PCR仅为10 ng），对粗提液可检测至10^–3稀释度；但特异性测试中，RPA对6种近缘双生病毒均出现扩增，存在交叉反应，提示其特异性有待提高。

RPA辅助CRISPR Cas12a系统提升特异性与灵敏度：联合RPA的高灵敏度与CRISPR的高特异性，该系统可特异性地从病株总DNA和粗提液中检测ChiLCV，实现准确诊断。

FAM-Biotin报告分子浓度决定LFA视觉输出：低报告浓度（如500 pM）下，病毒存在时T线显带（无C线），健康样本C、T线均显带；高浓度（如500 nM）下，无病毒时仅C线显带，低病毒量时C、T线均显带，高病毒量时仅T线显带；通过Logistic阈值建模确定500 nM为最佳浓度，此时阳性与阴性样本T/C值差异最大（阈值T/C<0.5为阴性）；优化孵育时间为25分钟。

LFA检测限达7 fg且特异性良好：以克隆DNA测试，LFA灵敏度为7 fg；特异性测试中，仅ChiLCV产生T线带（T/C>0.5），近缘病毒均为C线带（T/C<0.5）。

CRISPR-Cas12a LFA assay多地田间样本验证成功：系统可区分健康、螨害、蓟马害及ChiLCV感染样本（ROC曲线下面积=1）；对印度六地田间样本（包括无症状及疑似螨/蓟马害样本）检测显示，ChiLCV检出率一致（χ²=4.18，p=0.5244），无地域差异。

DETECTR成本略高但田间应用优势显著：成本分析显示，传统PCR、SYBR Green qPCR、探针qPCR每样本成本分别为4.2、4.8-6.0美元，而粗提液RPA-DETECTR为6.7美元，主要因Cas12a酶和LFA试纸条商用成本较高；但DETECTR省去核酸提取（成本0.25 vs. 1.80美元）、设备折旧低（0.01 vs. 0.16-0.40美元），且检测快（<1小时）、无需纯化核酸、仪器简单，适于田间部署；若实现Cas12a自产及试纸条本地化，成本可进一步降低。

讨论

本研究针对ChiLCV这一重要双生病毒，开发了首种可直接从粗提液中检测的CRISPR-DETECTR现场诊断平台。传统PCR/qPCR因病毒基因组高度同源难以区分近缘种，且依赖核酸纯化，而本系统通过整合RPA扩增与CRISPR-Cas12a靶向，兼具高灵敏（检测限7 fg，媲美qPCR）和高特异性（准确区分ChiLCV与ToLCNDV等近缘病毒），并能鉴别病毒与螨/蓟马危害症状。LFA读数优化表明，报告分子浓度影响结果判读：低浓度时病毒存在导致T线显带，高浓度时可区分病毒负载水平。田间多地验证证实该系统对自然感染样本（含无症状个体）检测稳健，为辣椒曲叶病的及时管理提供了可靠工具。尽管DETECTR耗材成本略高，但其快速、便携、免提取特性使其在田间 surveillance 中具有显著优势。

结论

本研究成功将DETECTR系统应用于植物病毒学领域，创建了RPA-CRISPR-Cas12a整合的ChiLCV即时检测平台。该技术通过荧光/LFA双读数实现快速、高灵敏、高特异性检测，尤其可直接用于粗提液，突破传统方法局限。研究不仅为ChiLCV防控提供了实用工具，也为其他植物病毒的现场诊断技术开发建立了范式，推动下一代植物病毒诊断技术的发展。