综述：持久菌细胞控制策略

《Frontiers in Pharmacology》：Mini review: Persister cell control strategies

本综述系统梳理了针对细菌持久菌（persisters）的新型控制策略，重点探讨了通过直接靶向细胞膜、间接调控代谢状态（如PMF、H2S、QS）以及利用AI辅助药物发现等手段，解决其抗生素耐受性难题，为慢性感染治疗提供新方向。

　　

什么是持久菌细胞？为什么它们很重要？

细菌持久菌是生长停滞的表型变异细胞，与亲代细胞相比没有基因突变。这些休眠细胞能耐受高剂量常规抗生素，并在抗生素撤除后恢复生长，对感染控制构成重大挑战。持久菌既可自发形成，也可由pH变化、营养限制和抗生素攻击等应激因子诱导产生。

常规抗生素通过抑制细菌生长发挥作用，主要靶向细胞壁合成、DNA复制和蛋白质合成等生长相关过程。但这些过程需要能量，在休眠持久菌中活性很低，导致常规抗生素难以根除它们。持久菌在囊性纤维化患者的慢性肺部感染、医疗器械相关感染和莱姆病等顽固性疾病中起关键作用，同时为抗生素耐药菌株的发展提供细胞库。

哪些策略被开发用于杀灭持久菌细胞？

尽管持久菌处于休眠状态，它们仍需保持细胞完整性和环境适宜时恢复生长的能力。因此，持久菌中保留了一些抗菌靶点，新策略可利用这些代谢休眠细胞的独特特性。

直接杀灭

靶向细胞膜

直接杀灭策略攻击生长非依赖性靶点如细胞膜，导致细胞裂解。膜损伤还能产生致死水平的活性氧（ROS），促进持久菌杀灭。多种制剂通过直接破坏细胞膜对持久菌或休眠细胞显示活性，包括2D-24、AM-0016、XF-70、XF-73、SA-558、TPP-Thy3和茶树精油成分等。

SA-558是一种合成阳离子转运体，破坏细菌稳态导致自溶。XF-70和XF-73通过破坏细胞膜有效杀灭金黄色葡萄球菌的非分裂和慢生长细胞。XF-73在光激活下产生ROS，氧化必需细胞成分。合成头孢菌素衍生物和负载萘替芬和氧合血红蛋白的红细胞膜包被纳米颗粒（Hb-Naf@RBCM NPs）能有效杀灭生物膜内的金黄色葡萄球菌持久菌。有机可溶抗菌聚合物纳米复合物和抗炎药semapimod也显示抗持久菌效果。带正电的银纳米壳纳米滴（C-AgND）与胞外聚合物（EPS）层的带负电成分相互作用，有效杀灭生物膜内的持久菌。

其他直接杀灭靶点

吡嗪酰胺是一种抗结核分枝杆菌持久菌的前药，其活性形式吡嗪酸破坏膜能量学，并与PanD（辅酶A生物合成必需）结合，触发ClpC1-ClpP降解PanD。ADEP4是一种半合成酰基depsipeptide，与ClpP蛋白酶结合引起构象变化，实现ATP非依赖性蛋白降解，导致超过400种细胞内蛋白分解，包括持久菌复苏必需的代谢酶，使细胞无法恢复生长。

直接裂解持久菌是一种有效方法，因为它不需要靶细胞的代谢活性。但若制剂也影响哺乳动物膜，将因脱靶毒性限制其治疗潜力。该领域需要更多关于持久菌生理学和新的持久菌特异性靶点的研究。

间接杀灭

持久菌细胞带来的挑战主要源于其休眠特性。概念上，可通过阻止细胞进入休眠或诱导它们退出持久状态来根除持久菌。一旦重新激活，这些细胞变得对抗菌药物更敏感。或者，如果细胞进入更深的无法复苏的休眠状态，实际上导致细胞死亡。利用休眠深度变化也可与其他治疗如抗生素产生协同效应。

抑制持久菌形成

虽然持久菌形成机制尚未完全阐明，多种策略显示可减少其形成。信息素cCf10通过减少(p)ppGpp警报子积累和保持代谢活跃状态，抑制粪肠球菌持久菌形成。抑制H₂S生物合成也能增强持久菌杀灭。H₂S通过清除自由基和增加抗氧化酶活性在应激条件下保护细菌。细菌胱硫醚γ-裂解酶（bCSE）是金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌中H₂S的主要产生者。CSE抑制剂减少生物膜形成和持久菌数量，并增强抗生素对两种细菌的效果。合成H₂S清除剂使金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和MRSA持久菌对庆大霉素敏感。

一氧化氮（NO）作为代谢干扰剂，匹维溴铵（PB）破坏PMF并产生ROS，也能有效防止持久菌形成。某些中链饱和脂肪酸如十一烷酸、月桂酸和N-十三烷酸减少持久菌形成。

持久菌形成在单个细胞水平受控，但细菌细胞间通过群体感应（QS）的信号传递也影响持久性。QS是细菌细胞间通信系统，响应细胞密度增加调节多细胞行为。QS信号绿脓菌素和N-(3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯通过诱导氧化应激和代谢变化增加铜绿假单胞菌持久菌形成。共享苯甲酰胺-苯并咪唑骨架的化合物结合QS调节因子MvfR，抑制铜绿假单胞菌的MvfR调节子，减少持久菌形成而不影响生长。类似地，作为QS抑制剂的溴化呋喃酮减少铜绿假单胞菌持久菌形成。

抗生素与其他因子的协同作用

增加膜通透性使持久菌对抗生素敏感。例如，MB6（一种有效的甲基氮杂二基双乙酰胺衍生物）和两种合成类视黄醇CD437和CD1530结合并嵌入MRSA脂质双层，破坏膜完整性，增加抗生素摄取。这些化合物与庆大霉素联合处理显示强抗持久菌活性。类似地，联合庆大霉素与膜活性化合物硫氯酚和nTZDpa杀灭MRSA持久菌。细胞穿透肽IMT-P8、多粘菌素B九肽（PMBN）和多粘菌素B衍生物SPR741也通过膜破坏发挥作用。此外，通过添加12个氨基酸将氨基糖苷类抗生素妥布霉素改造为转运蛋白序列，所得分子（Pentobra）在持久菌穿透和杀灭方面显示强活性。金纳米簇佐剂与氧氟沙星联合能有效杀灭持久菌，归因于AuNC@CPP超极化细胞膜和破坏质子梯度的能力。二氢吡咯烷酮-噻二唑通过结合心磷脂破坏生物膜完整性和细胞壁稳态，导致细胞壁破坏，与达托霉素在持久菌杀灭中显示协同效应。

另一种策略是联合多种抗生素根除持久菌。粘菌素与氨基糖苷类或环丙沙星配对，对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌持久菌有效。粘菌素能破坏外膜，促进其他抗生素穿透并增加其致死性。

除膜破坏外，抗菌药物可通过操纵膜通道获得更多穿透。非洛地平是FDA批准的二氢吡啶类钙通道阻滞剂，对哺乳动物细胞细胞毒性低。与庆大霉素联合时，治疗消散MRSA膜电位并增加细胞膜通透性。此外，非洛地平减少TCA循环和氨基糖苷耐药蛋白如AacA-AphD的表达。这些导致在小鼠模型中杀灭MRSA持久菌和生物膜细胞。

破坏质子动力（PMF）也阻碍外排泵活性，增加某些抗生素积累。益康唑是FDA批准的药物，消散PMF，与氨苄青霉素、庆大霉素或环丙沙星联合使用时杀灭持久菌。益康唑和头孢他啶联合处理在体内杀灭耐受细菌种群。外源腺苷和/或鸟苷增加四环素在灿烂弧菌持久菌细胞中的积累，并在复苏阶段导致细胞死亡。

与降低膜完整性和PMF的方法相反，增加PMF和ATP也可通过增加膜能量学降低细菌对抗生素的耐受性。更高PMF除促进ROS产生外，还驱动抗生素尤其是氨基糖苷类的摄取，增加其致死性。富马酸盐、正丁醇、小分子SA-558和L-赖氨酸等化合物通过增加抗生素摄取具有抗持久菌效果。需注意，对于增加细菌能量学的方法，应谨慎确保细菌不会恢复完全生长并压倒抗菌药物和宿主免疫系统。

持久菌杀灭中协同的其他机制

除化学制剂外，低离子冲击物理破坏细胞质膜，导致机械敏感通道激活。若在此过程中应用有效抗生素，可大量杀灭持久菌。低水平电流通过去极化细胞膜和促进离子及抗生素向持久菌细胞的被动扩散，增加抗生素对持久菌的杀灭。非转导噬菌体也与环丙沙星和氨苄青霉素协同对抗尿路致病性大肠杆菌培养物。

利用持久菌细胞的休眠特性

持久菌代谢休眠，因此外排活性降低。能通过被动扩散穿透持久菌细胞的制剂，若细胞内靶点可用且靶点结合强，可在复苏期间杀灭持久菌。这些标准有助于指导理性寻找持久菌控制剂。依拉环素是四环素家族的两亲性抗生素，可通过被动扩散进入持久菌细胞。有趣的是，它对持久菌细胞比正常细胞更有效，归因于持久菌细胞外排减少。以依拉环素为先导，通过化学信息学模型筛选小抗菌化合物库，通过聚类识别的11个候选化合物中有5个对持久菌细胞有效。这些发现为寻找新制剂提供有用见解。

驱使持久菌进入更深休眠状态

先前研究表明持久菌和可存活但不可培养（VBNC）状态并非截然不同，而是休眠谱中的阶段。从休眠持久性向难以复苏的VBNC转变的关键驱动因素是营养饥饿期间的蛋白质聚集。因此，通过驱使细胞进入更深休眠状态如VBNC可实现持久菌控制。随着未来更深入研究，这可能对抗生素治疗策略、慢性感染管理和复苏方案产生重大影响。例如，乳酸脱氢酶（参与丙酮酸代谢）促进大肠杆菌VBNCs复苏，增强氧化应激防御的细胞更可能复苏。寻找能阻止VBNCs复苏和/或进入更深休眠状态的新策略/控制剂也将杀灭持久菌。这仍是一个 largely 未探索的领域。

如何找到更好的持久菌控制剂？

由于持久菌细胞生长停滞，寻找持久菌杀灭剂应聚焦于非代谢活性依赖性靶点。这需要新知识和策略来识别这些靶点和新先导化合物。

人工智能（AI）和机器学习（ML）正快速改变药物发现，已用于寻找更好持久菌控制剂。AI特别是深度学习模型使研究人员能高效筛选数百万化合物抗菌活性，时间仅为传统方法一小部分。例如，筛选超过1.07亿个分子的化学库，导致发现新抗生素包括halicin。深度学习驱动的虚拟筛选成功应用于寻找抗代谢休眠细菌新制剂，如semapimod。该领域无疑将看到更多AI模型应用加速药物筛选和新模型开发。

为更好对抗持续感染，还需改变药物发现策略。对于持久菌控制，这需要从基于MIC的传统筛选转向休眠细胞中更特异性靶点。重要的是基于新机制识别持久菌穿透、靶点结合和杀灭活性的预测因子。获得重要知识的一种方法是利用微流控平台在受控环境中分离和操纵单个细菌细胞。整合AI可自动化成像和预测细胞命运，简化药物发现关键步骤。

为识别持久菌细胞中新靶点，必须深入了解持久菌形成机制和持久菌细胞的真实生理阶段。关于持久菌形成分子机制存在重大争论，部分源于缺乏可靠方法大量获得持久菌细胞和分离持久菌形成本身与诱导剂应用效应能力。持久菌种群异质性和形成随机性是另一挑战，可能通过新持久菌分离方案和单细胞RNAseq等技术解决。为更好根除持久菌细胞，所选药物需强结合靶点以克服休眠相关慢杀灭动力学。可通过修饰药物分子实现更强靶向包括共价结合。但由于这些分子更活跃，必须仔细考虑先导化合物活性和不良副作用可能性。

该领域还需应对持久菌靶向策略临床转化挑战。核心障碍围绕候选化合物递送至持久菌驻留的 niches，通常在生物膜内、宿主组织内或免疫细胞内。若靶点非细菌特异性和/或需要高剂量治疗剂，脱靶毒性也是关切。监管考虑可能引入进一步复杂性，如使持久菌治疗符合现有批准框架或引入新法规适应持续感染的复发和慢性性质。解决这些障碍对于将持久菌疗法从实验室推向临床实践至关重要。

通过利用人工智能和新生物技术工具的预测能力和速度，科学家现在能更高效发现抗持久菌药物。这标志着全球开发下一代持续感染治疗剂的努力向前迈出重要一步。