索拉非尼通过阻断细胞蛋白激酶抑制糖尿病视网膜病变中HIF-1α/VEGF轴的作用研究

《Frontiers in Endocrinology》：Growth factor and hypoxia-inducible factor alpha content in the retina of male Wistar rats in experimental diabetic retinopathy and the effect of cellular protein kinase blockade

本综述聚焦于糖尿病视网膜病变（DR）的核心发病机制——缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与血管内皮生长因子（VEGF）信号轴。研究通过动物实验证实，多激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）在协同胰岛素治疗时，能有效抑制视网膜内HIF-1α/VEGF的异常表达，并显著改善早期DR的病理形态学改变，为补充现有抗VEGF疗法提供了上游干预新策略。

　　

背景

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病患者视力丧失的主要原因之一。其核心病理生物学驱动因素是缺氧诱导的HIF1α–VEGF轴（缺氧诱导因子-1α – 血管内皮生长因子）上调，该轴促进血管新生并增加血-视网膜屏障（BRB）通透性，导致水肿、微血管病变和进行性神经退行性变。在正常氧条件下，HIF1α通过PHD/pVHL（脯氨酰-4-羟化酶结构域/Von Hippel-Lindau蛋白）依赖性机制被快速降解；而在缺氧条件下，它变得稳定并在转录水平上调VEGF及其他适应性基因。VEGFR2的上调调节内皮细胞存活、增殖和粘附连接（VE-钙粘蛋白），直接影响BRB通透性和水肿形成。因此，HIF1α–VEGF轴仍然是预防DR早期视网膜损伤的最有效验证靶点。

在生理条件下，VEGF主要位于神经节细胞层和视网膜色素上皮；在DR中，其表达扩展到Müller细胞、星形胶质细胞和缺血区域，与BRB功能障碍和神经血管单元重塑相关。这些变化是结构和功能性视觉损伤的基础；因此，靶向缺氧-血管新生信号节点是改变DR进展的逻辑策略。目前的治疗方法主要集中于受体后VEGF阻断（玻璃体内抗VEGF药物），这能有效减轻水肿和新血管形成，但存在局限性：反应可变性、注射负担以及对上游缺氧信号的不完全控制。另一个临床挑战是胰岛素治疗的影响：强化的血糖正常化可能通过HIF1α/VEGF依赖性机制暂时加剧BRB破坏，并且胰岛素使用与黄斑水肿的风险相关——这一背景强调了除血糖控制之外需要辅助策略。从概念上讲，多激酶抑制具有吸引力，因为它作用于调控级联的上游（中断MAPK/ERK信号和HIF1α稳定）以及VEGFR/PDGFR水平，可能补充抗VEGF治疗。

索拉非尼是一种多激酶抑制剂，靶向RAF（cRAF [细胞RAF丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶], BRAF [B-RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶]）和血管生成受体（VEGFR1/2/3, PDGFRβ），以及其他维持血管生成的酪氨酸激酶。临床前研究表明，索拉非尼降低HIF1α/VEGF水平、微血管密度和细胞侵袭性；从机制上讲，这些效应归因于MAPK/ERK轴的阻断、HIF1α核转位/与HRE（缺氧反应元件）结合的破坏以及通过抑制mTOR/RPS6KB1/4EBP1（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核糖体蛋白S6激酶B1/真核翻译起始因子4E结合蛋白1）通路对HIF1α翻译的抑制。同时抑制VEGFR2/3和PDGFRβ可能减轻通透性、内皮细胞增殖和病理性新血管形成——这些事件对DR进展至关重要。

材料与方法

为研究索拉非尼对DR中HIF1α/VEGF表达的影响，研究采用了链脲佐菌素（STZ）诱导的Wistar大鼠糖尿病模型，并比较了标准胰岛素治疗与胰岛素加索拉非尼联合治疗。定量评估通过Western blotting进行，VEGF定位通过免疫组织化学在预设时间点进行评估。所有实验程序均符合相关动物伦理规范。

研究涉及50只三月龄雄性Wistar大鼠。实验性糖尿病（DM）通过单次腹腔注射STZ（50 mg/kg）诱导。5只动物用于获取基线（完整）数据。STZ注射七天后，将患有持续性高血糖的动物（n=45）随机分为三组，每组15只。第1组（对照组）不接受高血糖治疗。第2组每隔一天腹腔注射短效胰岛素（30 U）。第3组接受与第2组相同的胰岛素方案，并额外每日口服一次索拉非尼（50 mg/kg）。动物在7天、28天和3个月时处死，进行后续分析。

免疫组织化学分析使用针对VEGF的单克隆小鼠抗体进行。通过Western blotting测定视网膜组织裂解物中VEGF和HIF-1α的含量，并使用β-肌动蛋白作为内参进行标准化。统计分析使用EZR v. 1.68软件进行，数据以中位数和四分位距表示，组间比较使用Kruskal-Wallis检验和Dunn's事后检验。

结果

在实验性DR条件下，视网膜组织中VEGF含量显著增加。观察3个月后，与完整动物相比，二聚体形式（前体蛋白）增加了6.8倍，单体形式（活性形式）增加了27.1倍。同样条件下，HIF-1α水平也显著增加（39.6倍）。

当给予胰岛素时，视网膜中VEGF组分的含量平均比初始数据高出5.0倍和18.3倍。与对照组相比，差异具有统计学意义，表明胰岛素对降低糖尿病视网膜VEGF过表达有一定效果（降低1.4-1.5倍）。但值得注意的是，在40%的动物中，VEGF含量显著降低（二聚体形式降低2.7倍，单体形式降低1.7倍），而在其余动物中则与对照组无差异，这指出了VEGF表达对胰岛素反应的异质性。

索拉非尼与胰岛素联合使用在所有情况下均阻断了由糖尿病引起的VEGF含量增加——视网膜中该生长因子的含量与基线数据无差异。

HIF-1α的初始水平（完整动物）低于方法的检测水平，表明正常大鼠视网膜组织中表达水平较低。3个月后，对照组其水平显著增加（与完整动物样本的光密度指标相比增加39.6倍），这对应于组织缺氧的发展。胰岛素给药使HIF-1α水平比对照组降低了1.4倍，而索拉非尼和胰岛素联合给药则与HIF-1α表达无法检测到相关。

免疫组织化学研究结果证实了在DR建模过程中视网膜组织VEGF表达的上调。在7天、28天和3个月时，观察到视网膜VEGF阳性染色强度增加的定性趋势。与完整动物中主要集中在神经节细胞层的微弱染色相比，DR模型动物中VEGF阳性视网膜元件（包括位于视网膜内表面的圆形细胞和内核层周边的Müller细胞）清晰可辨。在28天时，VEGF阳性神经纤维层星形胶质细胞和Müller细胞清晰可见，同时出现视网膜内层肿胀、分层以及神经纤维层血管新生灶的形成。观察3个月后，对照组动物视网膜出现明显水肿、丛状层缺血区域、神经节细胞变性迹象以及层状结构紊乱，特别是外核层包含无序的细胞增生，其中部分为VEGF阳性。

胰岛素的使用伴随着与对照组相似的视网膜图像，而索拉非尼和胰岛素的联合使用则阻止了DR形态学迹象的发展以及VEGF阳性染色强度的增加。索拉非尼+胰岛素治疗动物的视网膜未见水肿、缺血、病理性血管新生、神经变性或层状结构紊乱的迹象。在内核层和神经节细胞层保留了中度的VEGF阳性染色。

使用D.J. Dabbs量表对内核层VEGF特异性染色强度进行的半定量评估表明，对照组中以强染色细胞为主。胰岛素给药以及胰岛素联合索拉非尼导致未染色和弱染色细胞比例显著增加，同时强染色细胞数量减少。这些结果证实了胰岛素和索拉非尼对VEGF过表达的抑制作用。

讨论

关键发现与DR病理生物学的关联

在STZ糖尿病模型中，与胰岛素给药相结合的多激酶抑制与视网膜中HIF1α和VEGF的抑制以及视网膜结构的保存相关。这些观察结果与HIF1α–VEGF缺氧-血管生成轴在DR和BRB功能障碍中的核心作用一致，并与已知的在DR中VEGF免疫反应性从神经节细胞层/RPE正常分布到Müller细胞、星形胶质细胞和缺血区域的模式相符。

病理生理机制

在DR的背景下，慢性高血糖通过炎症、氧化应激、AGEs-RAGE轴等机制创造促血管生成微环境。早期的微血管事件加剧低灌注并稳定HIF1α，增加VEGF和NOS水平。在此背景下，胰岛素的作用是模糊的：在临床环境中，快速血糖改善可能伴随DR的早期恶化和黄斑水肿风险增加。在我们的实验中，这反映在VEGF对胰岛素反应的异质性上，并解释了为什么针对代谢控制的单一疗法仅部分影响HIF1α/VEGF。

索拉非尼的作用机制和作用位点

索拉非尼在两个层面起作用。上游：抑制cRAF/BRAF破坏MAPK/ERK节点，该节点支持HIF1α依赖性VEGF表达和血管生成转录组的扩展。受体水平：阻断VEGFR1/2/3和PDGFRβ抑制受体后事件。此外，还描述了通过mTOR/RPS6KB1/4EBP1抑制HIF1α翻译，以及干扰HIF1α核转位/与HRE位点结合。这些机制共同逻辑地解释了模型中缺氧驱动的血管生成反应的减弱。

临床相关性与安全性

玻璃体内抗VEGF治疗是黄斑水肿和新血管形成的标准疗法；然而，反应可变性、注射负担和上游驱动因素的持续存在仍是挑战。我们的数据支持互补概念：多激酶阻断可以减少HIF1α依赖性通路和VEGFR/PDGFR信号传导，理论上可在残余缺氧或高注射频率的情况下补充抗VEGF疗法。同时，我们并不提议将系统性索拉非尼作为DR的现成治疗方法：系统性给药的多激酶抑制剂类药物的安全性限制已有充分记录。因此，转化上更可行的方法似乎是局部递送模式或更具选择性的靶向RAF/MAPK或VEGFR/PDGFR且全身影响最小的药物。

局限性与未来方向

研究的局限性包括：仅使用雄性动物以最小化激素变异性；观察期覆盖早中期时间点，未评估晚期DR和长期干预结果；未包括功能终点如ERG和行为视力评估；多激酶抑制可能具有非视网膜后果。未来的方向自然源于这些局限性：将性别作为变量纳入研究；延长观察期以评估效果的持久性；功能验证以将HIF1α/VEGF动力学和形态学与视觉功能联系起来；以及测试局部给药方案和/或更具选择性的上游/受体节点抑制剂作为系统性多激酶阻断的潜在更安全替代方案。

结论与转化展望

我们的数据支持HIF1α–VEGF轴是DR早期缺氧驱动的血管生成变化的核心这一观点。胰岛素部分减弱这种活性但不能完全使其正常化，而将胰岛素与多激酶阻断相结合可防止VEGF上调和拓扑分布变化，在研究期间保持视网膜结构。从机制上讲，这些效应与索拉非尼的上游和受体水平作用一致，强化了其与抗VEGF策略互补的理论基础。在转化方面，局部或更具选择性的靶向方法似乎很有前景，但需进行仔细的安全性评估。我们的研究仅针对雄性、短期且缺乏功能性视觉指标，突出了在临床转化之前需要进行雌性研究、延长观察期和功能验证的需要。