综述：纳米孔直接测序技术与生物信息学分析在循环肿瘤DNA检测中的进展及其在癌症液体活检中的临床应用

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Advances of nanopore direct sequencing technology and bioinformatics analysis for cell-free DNA detection and its clinical applications in cancer liquid biopsy

这篇综述系统阐述了纳米孔测序技术（ONT）在循环肿瘤DNA（cfDNA）多组学检测中的独特优势，包括直接检测甲基化修饰、长读长测序和单次运行即可获得片段组学、表观遗传学和遗传学信息。文章详细总结了cfDNA的文库构建方法优化、生物信息学分析策略（如甲基化谱和拷贝数变异CNVs分析）及其在肺癌、脑癌等多种癌症中的临床应用，展望了该技术在未来精准医疗中的发展方向。

　　

1 背景

癌症作为全球主要健康威胁，2022年新增病例约2000万例，死亡病例约970万例。传统组织活检因侵入性和不可重复性存在局限，液体活检凭借其微创优势成为癌症早期诊断和疗效监测的重要工具。其中循环肿瘤DNA（cfDNA）作为关键生物标志物，其片段大小约167bp，半衰期仅数小时，携带包括片段组学、表观遗传学和遗传学在内的多组学信息。

新一代测序技术（NGS）虽广泛应用于cfDNA检测，但短读长限制使其难以单次运行获取完整片段长度特征。太平洋生物科学（PacBio）的长读长测序虽能克服此局限，却需高cfDNA投入量。而牛津纳米孔技术（ONT）凭借直接甲基化检测、无PCR扩增、长读长和高通量等优势，可实现cfDNA多组学信息的同步捕获。

2 cfDNA纳米孔测序的文库构建流程

纳米孔测序通过测量单链cfDNA穿过纳米孔时产生的电流信号直接识别序列和表观遗传特征。文库构建中的磁珠/样本比例优化对短片段cfDNA回收效率至关重要。Martignano团队首次将磁珠比例从0.8×提升至1.8×，显著增加测序 reads 产量；Lau团队通过替换末端修复连接酶并优化流程，使测序产量提升10倍，cfDNA投入量降至100pg。目前ONT推出单样本（SQK-LSK114）和多重样本（SQK-NBD114.24）专用建库方案，支持灵活临床需求。滚环扩增（RCA）与纳米孔测序结合可提升低频突变检测灵敏度，但会丢失表观遗传信息。

3 基于多维度cfDNA特征的生物信息学分析

3.1 cfDNA甲基化谱

DNA甲基化状态异常与癌症发展密切相关。纳米孔测序无需亚硫酸氢盐转化即可直接检测甲基化，为组织溯源提供新方法：Katsman团队利用25种健康组织甲基化图谱进行反卷积分析，量化cfDNA组织来源比例；Yu团队通过比较长cfDNA片段与肝癌组织、Buffy Coat的甲基化模式，实现单分子分类，肝癌甲基化评分诊断准确率达86%；Lau团队基于患者个体化肿瘤组织和PBMC甲基化图谱，通过双阈值系统分类cfDNA分子，纵向监测肿瘤负荷。当前研究重点仍集中于ctDNA与健康cfDNA的区分，利用ctDNA甲基化异质性解析肿瘤异质性将成为未来方向。

3.2 cfDNA拷贝数变异谱

CNVs作为癌症标志物，与肿瘤分型和预后相关。纳米孔长读长可避免GC偏好性和映射偏差，在低深度测序（约0.1X）下仍能精准检测CNVs。NanoGLADIATOR支持实时在线分析，ichorCNA兼具肿瘤分数（TF）估算功能。二者均通过校正GC偏差后的log₂比值识别增益/缺失区域，但对极低肿瘤分数样本的解析能力有限。

3.3 其他cfDNA特征

片段组学中，CCCA末端 motif 和片段长度（ctDNA通常短10bp）可作为癌症判别特征。Chen团队通过非负矩阵分解（NMF）整合片段长度分布估算TF，有效区分健康与癌症样本。SNVs和染色体重排检测需结合RCA或PCR技术：Marcozzi团队通过RCA-纳米孔测序检测TP53基因点突变；Sampathi团队通过IGH区域重排测序追踪B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）克隆动态。多组学整合策略可显著提升低TF样本的检测精度。

4 纳米孔cfDNA测序的临床应用

4.1 肺癌

Katsman团队通过甲基化图谱反卷积验证肺癌特异性cfDNA低甲基化特征；Martignano团队成功检测与耐药相关的基因CNVs，证明纳米孔测序与Illumina平台一致性高，为靶向治疗提供分子依据。

4.2 脑癌

中枢神经系统（CNS）癌症异质性强，传统活检受限。Afflerbach团队通过脑脊液（CSF）cfDNA的甲基化和CNVs分析，在无残留病灶样本中仍能检测ctDNA，双模态整合将检出率提升至100%。Sol和Schmidt团队分别诊断原发软疣样胶质母细胞瘤和血管内大B细胞淋巴瘤，突破淋巴瘤脑侵犯的诊断瓶颈。

4.3 其他癌症

Yu团队基于长cfDNA甲基化谱区分肝细胞癌（HCC）与乙肝病毒（HBV）携带者；Lau团队通过胃肠道癌症个体化甲基化图谱实现ctDNA动态监测；Marcozzi团队通过RCA-纳米孔测序检测头颈鳞癌（HNSCC）TP53突变，灵敏度达0.02% VAF；Chen团队的NanoRCS技术整合CNVs、SNVs和片段组学，显著提升食管腺癌（EAC）、卵巢癌（OVCA）等低TF样本的诊断效能。

5 展望与未来方向

纳米孔测序凭借数小时快速周转的优势推进临床转化，但仍面临低浓度cfDNA测序深度不足、分析工具适配性差及碱基识别错误率高等挑战。未来需优化建库流程、开发低深度数据分析算法，并通过多组学整合提升诊断可靠性。建立从采血到报告的标准化操作流程（SOP）将是推动该技术临床落地的关键。