枯草芽孢杆菌M-E6源γ-聚谷氨酸的微生物生产、多功能特性及优异冷冻保护活性研究

《Frontiers in Microbiology》：Microbial production and functional assessment of γ-polyglutamic acid isolated from Bacillus sp. M-E6

本研究从传统发酵食品中分离出Bacillus sp. M-E6，其γ-聚谷氨酸（γ-PGA）产量达4.9 g/L。经纯化鉴定，该γ-PGA分子量为60.42 kDa，具有高热稳定性（>600 °C）、优异的水合能力（WHC 196.21%）、乳化活性（79.33%）及显著抗氧化活性。尤为突出的是，其对益生菌（如Lacticaseibacillus rhamnosus）展现出卓越的冷冻保护效果（97.57%），流式细胞术验证了其优于传统冷冻保护剂的能力，为天然、生物相容性冷冻保护剂在食品、化妆品及生物医学领域的应用提供了有力依据。

　　

1 引言

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种由芽孢杆菌属（Bacillus）微生物产生的可食用、阴离子型、水溶性且可生物降解的微生物生物聚合物。其结构由D-谷氨酸、L-谷氨酸或两者混合物通过氨基和羧基之间的酰胺键连接而成。γ-PGA具有公认安全（GRAS）地位，因此被广泛用作食品和饲料工业中的多功能添加剂，并应用于冷冻保存和药物递送领域。其多样的生化特性，受对映体组成和分子量等因素影响，使其在多个领域具有应用潜力。

γ-PGA主要由于其在冷冻过程中对冰晶形成的抑制能力以及与细胞膜的相互作用，被探索作为传统冷冻保护剂（如DMSO和甘油）的潜在替代品，特别是在益生菌的冷冻保存方面展现出应用前景。

2 材料与方法

2.1 材料与化学品

实验所用试剂包括DEAE纤维素树脂、碘化丙啶（PI）、透析膜等，均购自知名供应商。益生菌菌株如Limosilactobacillus fermentum (MTCC-9748)和Lacticaseibacillus rhamnosus (MTCC-1423)购自相关菌种保藏中心。

2.2 γ-PGA生产菌的分离与筛选

从印度传统发酵食品（如Idli面糊）和发酵豆类中分离细菌。通过含有亚甲蓝的γ-PGA选择性培养基进行初筛，产γ-PGA的菌落周围会形成透明圈。

2.3 γ-PGA的生产

阳性菌株在液体生产培养基中于37°C、200 rpm振荡培养72小时。发酵液离心去除菌体后，上清液用预冷乙醇沉淀γ-PGA，透析后冻干备用。

2.4 γ-PGA的确认与定量

通过氨基酸分析和HPTLC确认产物为γ-PGA。采用紫外分光光度法在216 nm波长下定量γ-PGA。

2.5 菌株鉴定

对产量最高的菌株M-E6进行16S rRNA基因测序鉴定。

2.6 细菌生长动力学

研究菌株M-E6的生长曲线及其与γ-PGA产量和pH变化的关系。

2.7 γ-PGA的纯化

采用DEAE纤维素离子交换层析法纯化γ-PGA。

2.8 γ-PGA的表征

通过ESI-MS测定分子量；FT-IR和NMR分析结构；TGA评估热稳定性；SEM观察形态。

2.9 理化性质测定

测定水接触角、粒径分布、持水能力（WHC）、水溶性指数（WSI）、油结合能力（OBC）、乳化活性（EA）与稳定性（ES）以及絮凝活性。

2.10 抗氧化活性评估

通过ABTS自由基清除、还原能力、羟基自由基清除和FRAP实验评估抗氧化活性。

2.11 冷冻保护潜力评估

以标准平板计数法和流式细胞术（PI染色）评估γ-PGA对三种益生菌在经过冻融循环和-80°C储存后的保护效果，并与蔗糖、甘油对比。

3 结果与讨论

3.1 γ-PGA生产菌的筛选

从103个分离株中筛选出16个潜在γ-PGA生产者，菌株M-E6产量最高（4.9 g/L）。

3.2 γ-PGA的定量

16个菌株的γ-PGA产量范围为0.85至4.9 g/L。HPTLC分析证实产物含有L-谷氨酸单元。

3.3 γ-PGA生产菌的鉴定

菌株M-E6经16S rRNA测序鉴定为Bacillus sp. M-E6。

3.4 细菌生长与γ-PGA生产

菌株M-E6在48小时达到指数生长后期，γ-PGA产量在24至72小时期间持续增加，最高产量出现在72小时（4.9 g/L）。培养基pH从初始的6.4升至9.2。

3.5 γ-PGA的纯化

离子交换层析成功纯化γ-PGA，紫外扫描显示在216 nm有特征吸收峰，且无蛋白质和核酸污染。

3.6 分子量测定

ESI-MS测定纯化后的γ-PGA分子量为60.42 kDa。

3.7 FT-IR光谱分析

FT-IR光谱显示出γ-PGA的特征吸收峰：3425 cm^-1（O-H伸缩振动），1650 cm^-1（酰胺I带，N-H弯曲），1556 cm^-1（酰胺II带，伸缩振动），1094 cm^-1（C=O对称伸缩），证实了其结构。

3.8 核磁共振（NMR）分析

¹H NMR显示化学位移：α-CH质子（4.12 ppm），γ-CH₂质子（2.35 ppm），β-CH₂质子（2.07和1.92 ppm）。¹³C NMR显示位移对应于α-CH₂（54.96 ppm），γ-CH₂（32.37 ppm），β-CH₂（27.80 ppm），酰胺羰基（175.07 ppm）和羧基（178.55 ppm），进一步确认了γ-PGA的γ-连接结构。

3.9 热重分析（TGA）

TGA显示该γ-PGA具有极高的热稳定性，分解温度（T_d）高于600°C。在125-175°C仅失重7%，500°C时失重42%。

3.10 扫描电子显微镜（SEM）

SEM图像显示γ-PGA呈多孔颗粒状形态，具有海绵状结构，这种形态有利于其作为稳定剂、增稠剂或用于制备水凝胶。

3.11 γ-PGA的理化性质

水接触角为26°，表明其强亲水性。平均流体动力学直径为396.5 nm。持水能力（WHC）为196.21%，水溶性指数（WSI）为96.64%。油结合能力（OBC）为104.78%。对橄榄油的乳化活性（EA）最高，达79.33%，24小时后乳化稳定性（ES）为70%。絮凝活性为29.32%。

3.12 γ-PGA的功能特性：抗氧化活性

γ-PGA展现出显著的浓度依赖性抗氧化活性。在1 mg/mL时，ABTS⁺自由基清除率达85.52%。在20 mg/mL时，还原能力为155.41 ± 4.82 μg AAE/mg，羟基自由基清除活性为254.10 ± 5.357%，FRAP值也最高。

3.13 γ-PGA作为冷冻保护剂

3.13.1 标准平板计数

经过冻融循环和-80°C储存后，γ-PGA对三种益生菌均表现出优异的冷冻保护效果。对于LcS. rhamnosus，5% γ-PGA处理后的活菌数损失仅0.01 log CFU/mL，优于10%蔗糖（0.04 log CFU/mL）。对于S. thermophilus，10% γ-PGA处理后的损失也仅为0.01 log CFU/mL。与不含保护剂的对照组（损失达1.99和1.27 log CFU/mL）相比，γ-PGA的保护作用极其显著。

3.13.2 流式细胞术

流式细胞术使用PI染色更快速准确地量化了活菌和死菌比例。结果与平板计数趋势一致，但检测到的活菌比例通常更高，可能因为其能检测到可存活但不可培养（VBNC）状态的细胞。例如，10% γ-PGA对Lmb. fermentum的活菌保护率达97.51%，对LcS. rhamnosus达97.57%，5% γ-PGA对S. thermophilus的保护率达93.47%，均与或优于传统冷冻保护剂。

4 近期应用进展与局限性

近期研究拓展了γ-PGA在生物医学（如纳米药物载体）、农业微凝胶、作物增产等方面的应用。然而，其大规模生产、成本控制、对映体复杂性导致的生物相容性差异以及法规要求仍是其广泛商业化的挑战。

5 结论

本研究从传统发酵食品分离的Bacillus sp. M-E6中成功生产并表征了γ-PGA。该γ-PGA具有高分子量、高热稳定性、优异的水合特性、乳化性和显著的抗氧化活性。最重要的是，其对多种益生菌展现出卓越的冷冻保护能力，效果媲美甚至优于传统冷冻保护剂。结合其生物相容性和可生物降解性，该γ-PGA在食品工业（作为稳定剂、增稠剂、冷冻保护剂）、医药和化妆品等领域具有广阔的应用前景。本研究通过流式细胞术等先进方法验证了其功能，为其作为天然多功能生物聚合物的应用提供了坚实依据。