SARS-CoV-2刺突蛋白优势B细胞线性肽表位的鉴定及其抗体反应特征研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Identification of dominant peptide epitopes and antibody response to the spike protein of SARS-CoV-2

本综述系统探讨了SARS-CoV-2刺突蛋白中六个线性B细胞表位的免疫反应特性。研究通过免疫表位数据库筛选出P1-P6肽段，利用点杂交技术分析COVID-19患者与灭活疫苗接种者血清抗体反应。结果显示P2、P5、P6为优势表位，其中P2反应最强且最早出现。研究揭示了自然感染与疫苗接种诱导的抗体谱差异，为开发高特异性肽基血清学诊断试剂提供了关键靶点。

　　

引言

2019冠状病毒病是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型引起的全球大流行。SARS-CoV-2基因组编码四种结构蛋白——刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白，以及16种非结构蛋白和其他辅助蛋白。刺突蛋白包含两个亚基：S1亚基识别宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2受体，S2亚基介导病毒膜与宿主膜的融合。

人类感染SARS-CoV-2后会触发免疫反应。感染后血清中可检测到不同亚型的抗SARS-CoV-2抗体，包括IgM、IgG和IgA。SARS-CoV-2感染引发的特异性抗体动态通常遵循病毒暴露后抗体产生的特征模式。IgG在抗病毒免疫中起主要作用，是疫苗接种后监测和评估免疫状态的关键标志物。此外，IgG被认为是SARS-CoV-2感染的重要辅助诊断指标，在确诊COVID-19的成人中检测率达95%。

源自SARS-CoV-2的B细胞抗原表位刺激免疫系统产生抗体，其中中和抗体通过与特异性中和抗原表位结合来阻断病毒入侵和复制。B细胞表位分为构象表位和线性表位。构象表位由蛋白质三维结构中空间相邻的不连续氨基酸残基组成。相比之下，线性表位由连续氨基酸序列组成，易于合成和验证，使其在免疫学研究和疫苗开发中特别有用。

材料与方法

本研究招募了69名个体，包括45名接种了两剂灭活BBIBP-CorV疫苗的志愿者、20名无SARS-CoV-2感染史的未接种志愿者以及4名确诊COVID-19患者。收集的血清分为三组：疫苗接种组、未接种组和确诊COVID-19组。所有参与者均按照赫尔辛基宣言获得知情同意。本研究获得梅州市人民医院伦理委员会批准。

使用IEDB的在线BepiPred 2.0工具预测SARS-CoV-2武汉-Hu-1刺突蛋白上的线性B细胞表位。筛选出至少五个连续氨基酸且每个表位概率评分≥0.5的线性肽段进行进一步验证。所选肽段与牛血清白蛋白偶联并由生工生物工程股份有限公司合成。使用PyMOL将免疫原性肽的结构数据可视化于SARS-CoV-2刺突蛋白上。从NCBI数据库获取各种流行变异株的刺突蛋白序列，使用Clustal Omega进行多序列比对并通过Jalview可视化。

使用2019-nCoV IgM/IgG抗体检测试剂盒检测未接种组和疫苗接种组血清样本中的SARS-CoV-2刺突蛋白特异性IgM和IgG抗体。采用Simple Western系统进行Western blotting分析。点印迹分析中，将重组SARS-CoV-2刺突蛋白、无IgG的BSA和肽段-BSA偶联物点样到聚偏二氟乙烯膜上，与各组血清孵育后通过化学发光法检测信号。

结果

优势线性B细胞表位的鉴定

通过IEDB的BepiPred 2.0预测工具从SARS-CoV-2刺突蛋白中鉴定出六个线性B细胞肽段，分别命名为P1-P6。这些肽段的氨基酸序列和位置如表1所示。肽段与BSA偶联后用于后续实验。将优势表位映射到刺突蛋白结构上显示，除P3位于蛋白质表面的凹槽外，其余五个肽段均位于刺突蛋白表面。

肽段与商业抗刺突蛋白多克隆抗体的反应性

通过Simple Western分析六个优势肽段与商业抗SARS-CoV-2和抗SARS-CoV刺突蛋白多克隆抗体的反应性。银染证实六个肽段的蛋白上样量相等。P1、P2、P5和P6与商业抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体发生反应，而与商业抗SARS-CoV刺突蛋白抗体的反应显示P1、P2和P5具有反应性。P4与两种商业抗刺突蛋白抗体均未观察到交叉反应。与抗SARS-CoV刺突蛋白抗体相比，P6仅与抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体显示强反应性。

确诊COVID-19患者血清IgG抗体的肽段反应性

通过点印迹评估六个肽段与四名确诊COVID-19患者住院不同阶段血清的反应性。在感染早期，所有四名患者血清中均检测到强抗P2抗体信号，并在整个住院期间持续存在。随着疾病进展，两名患者血清中逐渐出现抗P5抗体信号，而另外两名患者未见此类反应。P1、P2、P4和P6的抗体信号未检测到或较弱。这些发现表明不同抗原表位具有显著不同的免疫原性和反应性。在六个肽段中，P2似乎是最具免疫原性和反应性的，针对它的抗体出现最早。此外，针对P5表位的抗体反应在患者之间存在差异。

疫苗接种志愿者血清IgG抗体的肽段反应性

点印迹分析显示，疫苗接种者血清中的抗体至少与P2、P5或P6中的一个肽段结合。与COVID-19组相比，部分疫苗接种者产生了针对P6的IgG抗体。在疫苗接种组中，仅含P2反应性抗体的血清占55.6%；仅含P6的占11.1%；仅含P5的占2.2%。此外，能够结合两个或三个肽段的血清比例分别为：P2+P5、P2+P6、P5+P6和P2+P5+P6。总体而言，P2在疫苗接种组中阳性反应率最高，达84.4%，其次是P6，阳性率为31.1%，P5阳性率最低，为22.2%。在接种两剂灭活疫苗的个体中未检测到与P1、P3和P4反应的抗体。当一些未接种个体的血清与SARS-CoV-2刺突蛋白孵育时观察到弱反应信号，但与六个肽段均未检测到反应性，表明P2、P5和P6肽段作为检测SARS-CoV-2抗体的试剂可能比刺突蛋白更具特异性。

肽段与SARS-CoV-2变异株的多序列比对

将六个B细胞线性肽段的氨基酸序列与Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron亚变种的相应区域进行比较。P1、P2和P5在不同变异株中显示氨基酸突变：P1中第211、212和213位点在多个变异株中发生突变；P2在Alpha株中含有A570D突变，在NB.1.8.1株中含有E554K突变；P5在所有流行变异株中均存在D614G突变。相比之下，P3、P4和P6在所有变异株中高度保守。

讨论

本研究通过IEDB筛选出刺突蛋白中六个具有免疫优势的线性B细胞肽段，并通过点印迹评估其与临床收集血清样本的反应性。尽管COVID-19患者和疫苗接种志愿者的血清对六个肽段表现出不同的反应性，但P2、P5和P6在两个组中均表现出强IgG抗体反应性。P2在血清样本中出现频率最高且抗原反应信号最强。在SARS-CoV-2感染早期所有患者中均检测到抗P2抗体，而抗P5抗体出现在疾病中期；未检测到针对其他四个肽段的抗体。然而，在一些疫苗接种者中观察到抗P6抗体，表明个体接种疫苗后产生不同的抗体谱。

个体间IgG抗体谱的差异在COVID-19患者和疫苗接种者中均有报道。使用S蛋白肽段微阵列分析显示，接种两剂灭活病毒疫苗BBIBP-CorV个体的血清IgG抗体更易识别刺突蛋白的多个肽段区域。这些发现表明mRNA疫苗BNT162b2和灭活疫苗BBIBP-CorV引发的抗体谱在S1-NTD和RBD区域显示重叠，但在其他主要抗原位点表现出明显差异。

本研究中鉴定的P2、P5和P6位于S1-CTD区域或S2'切割位点区域。这些表位完全涵盖先前报道的免疫优势表位并显示延长的氨基酸长度。特别值得注意的是，P5和P6超出S1-105+S1-106和S2-22+S2-23组合区域的延伸序列并非冗余，可能有助于提高抗体检测率。疫苗接种个体与自然感染个体之间的抗体反应谱存在差异，这与先前研究一致。

三个免疫优势线性B细胞表位均位于刺突蛋白表面，有利于抗体结合。尽管所有三个肽段都位于刺突蛋白表面，但P5和P6在疫苗接种者中反应性较低可能是由于刺突蛋白三聚体空间构象的部分屏蔽阻碍了抗体识别。接种BNT162b2疫苗的健康个体中抗RBD IgG抗体水平高于恢复期患者。本研究中在COVID-19患者血清中观察到抗P2和P5抗体，而在接种BBIBP-CorV的个体血清中检测到针对三个肽段及其组合的抗体，表明不同个体引发的抗体谱存在差异。

六个肽段分别与商业兔抗SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突蛋白多克隆抗体发生反应。其中仅P6与抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体显示强特异性反应。肽段P1、P2和P5与两种抗刺突蛋白抗体均发生免疫反应，可能由于这两种病毒在这些肽段区域高度同源。然而在确诊COVID-19患者血清中未观察到P1和P6的抗原抗体反应，这种差异可能反映了商业抗体试剂与自然感染SARS-CoV-2个体血清之间的不同。

血清学检测在COVID-19诊断和暴发监测中起关键作用。大多数商业COVID-19血清学抗体诊断试剂盒使用全长蛋白或刺突蛋白、RBD区域和核衣壳蛋白等作为抗原，这些抗原可能与先前感染其他HCoV个体的血清发生交叉反应。持续突变也给SARS-CoV-2传播过程中的抗原选择带来不确定性。与全长蛋白相比，线性肽段具有易于制备、纯度高和成本低等优势，使其成为血清学分析的有吸引力的靶标。

不同SARS-CoV-2变异株在传播过程中不断进行重组和突变。通过多序列比对发现，P2在Alpha变异株中存在A570D突变，在Omicron NB.1.8.1株中存在E554K突变。P5在所有比较的毒株中持续存在D614G突变，而P6高度保守。变异株中的D614G突变与传播性增强、适应性提高和病毒载量升高相关。此外，Alpha变异株中A570D和D614G突变的组合可促进RBD构象变化，从而增强病毒感染性。NB.1.8.1作为JN1的后代谱系携带E554K突变，可能通过干扰靶向CTD SD1区域的单克隆抗体的中和作用来促进免疫逃逸。

在未接种组中，刺突蛋白与部分个体血清IgG抗体显示弱斑点反应，而肽段P2、P5和P6未显示免疫反应性，表明这些肽段比刺突蛋白更具特异性。由于免疫反应的个体差异，每个肽段的IgG抗体检测率差异很大。不同肽段的组合可能提高整体阳性检测率，并作为疫苗接种后抗体保护的监测方法。P2、P5和P6组合是否具有疫苗接种后的诊断和监测潜力需要通过大规模采样和中和试验在未来研究中验证。