基于非靶向代谢组学的创伤性凝血病早期诊断生物标志物筛选研究

《Frontiers in Endocrinology》：Screening of biomarkers for early diagnosis of trauma-induced coagulopathy based on untargeted metabolomics

本研究通过非靶向代谢组学技术筛选创伤性凝血病（TIC）早期诊断生物标志物，发现LysoPE(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)和LysoPE(0:0/18:2(9Z,12Z))两种溶血磷脂酰乙醇胺具有优异诊断效能（AUC>0.9），其诊断性能显著优于常规凝血检测（PT/APTT）和入院评分（GCS/ISS），为TIC早期干预提供了新策略。

　　

引言

创伤是全球范围内导致死亡的主要原因，未控制的出血与创伤性凝血病密切相关，是创伤后早期死亡的最常见原因。创伤性凝血病是在创伤早期发生的凝血障碍综合征，最初表现为低凝状态的大出血，随后转为高凝状态，伴随静脉血栓形成和多器官功能衰竭。流行病学研究表明，约25%-33%的重伤患者入院时即出现创伤性凝血病，其病死率比无凝血障碍患者高4-6倍。

目前临床诊断主要依赖常规凝血检测，但这些方法存在周转时间长、无法全面评估凝血酶生成和纤溶系统状态等局限性。代谢组学作为系统分析生物体内小分子代谢物动态变化的交叉学科方法，为探索创伤性凝血病早期诊断生物标志物提供了新思路。

研究方法

临床样本采集

本研究经湖南省人民医院伦理委员会批准，采用回顾性病例对照设计。共收集81例血清样本，包括54例创伤患者和27例健康对照。创伤患者样本均在伤后24小时内采集。病例组为27例创伤性凝血病患者，对照组按年龄、糖尿病、高血压、冠心病等预后因素进行个体匹配。

创伤性凝血病诊断标准包括实验室指标和临床表现两方面。实验室标准需满足凝血酶原时间>18秒、活化部分凝血活酶时间>60秒、凝血酶时间>15秒或凝血酶原比率>1.6中的至少一项；临床标准为需要输血或替代治疗的活动性或潜在出血。

样本处理与质控

样本处理前加入含有稳定同位素标记化合物的内标混合物，以监控样本制备和仪器分析过程中的变异。采用80%甲醇水溶液进行蛋白沉淀，经两次离心后取上清液进行液相色谱-质谱联用分析。

数据分析与质量控制

使用Compound Discoverer 3.1软件处理原始数据，代谢峰对齐的保留时间偏差容差≤0.2分钟，质量偏差容差≤5ppm。通过制备混合质控样本评估数据质量，相对标准偏差>30%的代谢物被剔除，确保数据可靠性。

代谢组学分析结果

多变量统计分析显示，创伤性凝血病患者、非创伤性凝血病创伤患者和健康对照三组间的代谢物谱存在显著差异。主成分分析发现组内差异小但组间差异显著，偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析进一步证实了这种分离趋势。200次置换检验验证了所有正交偏最小二乘判别分析模型的可靠性。

差异代谢物筛选

通过结合多变量和单变量分析，在创伤性凝血病与非创伤性凝血病组间筛选出74个差异代谢物，其中72个上调，2个下调。代谢通路分析显示，肌醇磷酸代谢和丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢是区分两组的关键代谢通路。

生物标志物鉴定与验证

以倍数变化>2.0、调整后P值<0.05、变量重要性投影>1.5和曲线下面积>0.9为标准，筛选出五种差异代谢物作为候选生物标志物。排除三种外源性化合物后，最终确定LysoPE(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)和LysoPE(0:0/18:2(9Z,12Z))为具有高诊断价值的潜在生物标志物。

LysoPE(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)的曲线下面积为0.933，敏感性和特异性分别为0.963和0.815；LysoPE(0:0/18:2(9Z,12Z))的曲线下面积为0.916，敏感性和特异性分别为0.963和0.852。留一法交叉验证得到的曲线下面积分别为0.929和0.885，表明这两个生物标志物具有稳定的诊断性能。

与传统诊断方法的比较

目前创伤患者入院评估指标和常规凝血检测在创伤性凝血病预测方面表现不佳。虽然凝血酶原时间、凝血酶原时间-国际标准化比值、凝血酶原时间百分比和活化部分凝血活酶时间在两组间有显著差异，但其诊断效能远低于本研究发现的两种差异代谢物。

讨论与展望

本研究首次通过代谢组学方法筛选出创伤性凝血病早期诊断的高效生物标志物。两种溶血磷脂酰乙醇胺分子在创伤性凝血病患者中表现出相反的变化趋势：LysoPE(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)显著升高，而LysoPE(0:0/18:2(9Z,12Z))显著降低，这种差异可能反映了创伤性凝血病不同病理阶段的动态特征。

代谢通路分析提示肌醇磷酸代谢通路可能通过影响钙离子释放和血小板活化参与凝血异常。该通路产生的肌醇三磷酸可促进细胞内钙库释放和细胞外钙内流，增加细胞内钙浓度，进而导致血小板活化和血栓形成。

本研究为单中心研究，样本量相对有限，未来需要在多中心大样本队列中进行外部验证。同时，所有样本均在伤后24小时内采集，未能实现对两种溶血磷脂酰乙醇胺的连续动态监测。后续研究应结合转录组学和蛋白质组学，深入探索代谢-凝血相互作用网络，并通过体外实验验证差异代谢物的具体作用机制。

综上所述，本研究为创伤性凝血病的早期诊断提供了新的生物标志物，为改善患者预后和降低死亡率开辟了新途径。