基于UHPLC-MS优化色谱分离策略消除藏红花素源内裂解干扰及其在密蒙花与黄饭中的应用研究

《Frontiers in Plant Science》：Development of a UHPLC-MS method to avoid the in-source dissociation interference in characterization of crocins from Buddlejae flos and its dyeing yellow rice

本研究开发了一种通过优化色谱分离来避免超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析中源内裂解（ISD）干扰的方法，成功鉴定了密蒙花中28种藏红花素（crocins）及其衍生物，显著提升了复杂样品中藏红花素检测的灵敏度与准确性，为密蒙花质量控制及其在合成生物学中的潜在应用提供了可靠分析工具。

　　

2 Materials and methods

2.1 Materials and chemicals

实验所用液相色谱-质谱（LC-MS）级甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和甲酸（FA）购自Fisher Scientific UK Ltd.。超纯水（H₂O）由Research Scientific Instrument Co., Ltd.的超纯水系统制备。全反式藏红花素I（1）、全反式藏红花素II（2）、全反式藏红花素III（3）、全反式藏红花素IV（4）和全反式藏红花酸（6）等标准品分别从不同的生物技术公司购买，纯度均≥95%。粳糯米、藏红花（ saffron）、栀子果实（Gardenia fruit）以及21批次的密蒙花（Buddlejae flos）均从正规渠道采购，所有密蒙花产品均附有公司的产品合格证书。

2.2 Sample preparation

标准品混合溶液（含1, 2, 3, 4, 6，各1.5 μg/mL）用甲醇配制，用于定量方法验证和实际样品测定。

藏红花、栀子果实和密蒙花样品经冷冻干燥、粉碎后，于-20°C保存。精密称取约20 mg药材粉末（n=5），加入2 mL甲醇，在40 kHz超声波浴中提取三次（每次20分钟），随后在4°C、5000 rpm条件下离心10分钟。合并三次上清液（约5.5 mL），用氮气（N₂）吹干。用于定性分析时，残留物用200 μL甲醇复溶，并经0.2 μm滤膜过滤，制成供UHPLC-MS分析和UHPLC指纹图谱分析的样品溶液。

黄饭的制备过程为：称取16 g密蒙花，加入0.7 L水于锅中加热10分钟，然后加入380 g米饭煮15分钟。冷却后，称取10 g黄饭（n=3），按上述方法用甲醇提取，提取液经氮吹干后，用200 μL甲醇复溶，0.2 μm滤膜过滤后供UHPLC-MS分析。

2.3 UHPLC-UV analysis

色谱分离在Agilent 1290 UHPLC系统上完成，使用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（Waters, 100 × 2.1 mm, 1.7 μm）和相应的保护柱，柱温维持在40°C。流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A）和乙腈（B），流速为0.3 mL/min。优化的梯度洗脱程序如下：0–5分钟，B相从10%升至25%；5–42分钟，B相从25%升至41.5%；42–43分钟，B相从41.5%升至90%，随后用90% B冲洗柱并重新平衡至10% B。检测波长为440 nm。进样体积为5 μL。

2.4 UHPLC-MS analysis

定性分析使用Agilent UHD 6546 Q-TOF质谱仪，配备Jet Stream电喷雾电离（ESI）源，在负离子模式下进行。质谱扫描范围设为m/z 100–1500；二级质谱（MS/MS）扫描范围设为m/z 50–1200。质谱参数包括：干燥气流速12 L/min，温度350°C；鞘气流速12 L/min，温度350°C；雾化器压力30 psig；毛细管电压3.5 kV；喷嘴电压0.8 kV；碎裂电压180 V等。进行MS/MS分析时，碰撞能量在10至40 V之间调整。

定量分析使用Agilent 6495三重四极杆（QQQ）质谱仪，同样在负离子模式下运行。质谱参数包括：干燥气流速18 L/min，温度280°C；鞘气流速12 L/min，温度350°C；雾化器压力60 psig；毛细管电压2.5 kV；喷嘴电压1.0 kV等。采用动态多反应监测（dMRM）模式，具体监测离子对参数见表1。

2.5 Quantitative method validation

定量方法在线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、稳定性、精密度和回收率等方面进行了验证。线性关系通过配制一系列浓度（0.25至1500 ng/mL）的标准品混合溶液（每个浓度三个样本）进行评估。使用GraphPad Prism 10软件进行回归分析。LOD和LOQ分别定义为信噪比（S/N）约为3和10时的浓度。稳定性通过连续三天（每天一次进样，n=5）分析样品中内源性藏红花素的含量，计算相对标准偏差（RSD）来评估。日内精密度（重复性）通过一天内对同一样品进行六次分析（n=6）计算RSD；日间精密度（重现性）通过三天内进行18次分析（每天六个样本，n=18）计算RSD。方法回收率通过向样品中添加已知量的藏红花素I（240 ng或360 ng）和藏红花素II（27 ng或40 ng）标准品（n=6），比较测定值与实际添加量来计算。

2.6 Data analysis and statistical analysis

高分辨质谱、MS/MS数据以及dMRM数据使用Agilent Mass Hunter Workstation Software处理。样品中藏红花素及其衍生物的定量结果使用标准品的线性回归方程计算。藏红花素III和藏红花酸的线性方程分别用于测定藏红花素VI和甲基化藏红花素。藏红花素的线性方程用于其衍生物的定量。定量数据导入GraphPad Prism 10软件进行统计分析。所有数据均以均值±标准差（Mean ± SD）表示。采用Welch's t检验进行数据分析，p < 0.05认为具有统计学显著性。为了比较密蒙花、藏红花和栀子果实中不同数量级的数据，采用了z-score（z = (x - μ)/σ）进行数据标准化，以便在散点图中更直观地展示模式。

3 Results and discussion

3.1 Establishment of an improved UHPLC-MS method for the analysis of crocins and their derivatives

在质谱分析中，葡萄糖缀合的代谢物可能因源内碰撞诱导解离（in-source collision-induced dissociation）而丢失糖基，回归到其非糖基化形式，这在藏红花素的分析中尤为常见。为了研究弱色谱分离条件下源内裂解干扰对藏红花素质谱分析的影响，研究首先在梯度程序1（Gradient 1）下对密蒙花中的藏红花素进行了UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。结果显示，在藏红花素III（理论m/z 651.2658）的提取离子流图（EIC）中，有三个明显的峰（保留时间RT分别为9.92分钟、13.25分钟和13.60分钟）。然而，RT 9.92分钟处的离子质谱图显示存在m/z 975的离子，表明该处存在藏红花素I或其异构体。同样，在藏红花素I（理论m/z 975.3715）的EIC中，RT 6.05分钟和10.06分钟处有两个明显峰。RT 10.06分钟处的离子质谱图同时存在m/z 975和m/z 651的分子离子，表明在梯度程序1下，藏红花素及其异构体发生了共洗脱，导致对藏红花素III或藏红花素I异构体的误判。

为了获得更合适的流动相梯度，研究测试了不同的梯度程序。最终确定的梯度程序（梯度程序2，Gradient 2）能够在40分钟内实现所有检测到的藏红花素及其衍生物的基线分离。优化后，藏红花素及其衍生物获得了良好的色谱分离效果。例如，m/z 651在RT 14.57分钟的峰与m/z 975在RT 15.92分钟的峰实现了良好分离；原本在梯度1下重叠的m/z 651峰（RT 13.25分钟）被分离为RT 29.21分钟和29.48分钟的两个峰。质谱图显示，在RT 6.04分钟和15.92分钟的m/z 975离子仍然伴随有m/z 651离子，说明藏红花素I及其异构体在电离过程中确实会产生类藏红花素III的离子，但在优化后的色谱条件下，这些离子因分离良好而不再干扰目标化合物的鉴定。此外，良好的色谱分离也减少了对藏红花素检测的离子抑制基质效应。与梯度程序1相比，改进后的方法（梯度程序2）显著增强了13种藏红花素及其衍生物的质谱信号响应，包括2种藏红花素I、2种藏红花素II、4种藏红花素III、藏红花素IV、3种藏红花素V和藏红花酸，尤其是藏红花素II iso-2、藏红花素III和藏红花素IV的信号增强可达两倍。

3.2 Analytical strategies for the identification of crocins and their derivatives in Buddlejae flos

化合物的鉴定策略结合了高分辨Q-TOF-MS提供的精确质量数（用于确定化学式）和MS/MS谱图提供的特征碎片离子信息（用于解析结构骨架）。例如，一个内源性的藏红花素II候选物（去质子化前体离子m/z 813.3187）与藏红花素II标准品在RT 7.01分钟共洗脱，被鉴定为藏红花素II（化学式C₃₈H₅₄O₁₉）。其MS/MS图谱显示出一系列连续丢失葡萄糖基团的中性碎片离子：从m/z 813到651（丢失一个葡萄糖基），从m/z 651到489（再丢失一个葡萄糖基），以及从m/z 489到327（再丢失一个葡萄糖基），这与藏红花素II标准品的碎片模式完全匹配，从而确认了密蒙花提取物中内源性藏红花素II的鉴定。

对于无法获得标准品的藏红花素V和藏红花素异构体，则主要依据其精确质量和高分辨MS/MS数据进行鉴定。例如，一个候选物（去质子化前体离子m/z 489.2130）被鉴定为藏红花素V（化学式C₂₆H₃₄O₉）。其MS/MS图谱中，m/z 327的离子是由前体离子丢失一个葡萄糖基产生，表明该化合物含有一个葡萄糖基；碳链上的有序断裂产生了m/z 283和239等碎片离子，这与藏红花酸标准品的碎片模式相符，从而支持了藏红花素V的结构鉴定。

为了进一步确认鉴定结果，研究还获取了这些化合物的特征紫外（UV）光谱。结果显示，藏红花素和藏红花酸在约440纳米和460纳米处有最大吸收。此外，对21批次密蒙花进行的UHPLC指纹图谱分析表明，其图谱相似度均大于0.9，显示了样品质量的一致性。

综合运用上述分析策略，研究最终从密蒙花材料中鉴定出28种内源性藏红花素及其衍生物。

3.3 Method validation for the quantitation of crocins and their derivatives in Buddlejae flos

定量方法验证结果表明，该方法适用于密蒙花中藏红花素及其衍生物的定量分析。对于藏红花素和藏红花酸标准品，在其预期的浓度范围内均表现出良好的线性关系，决定系数（r²）均高于0.999。通过回归线的斜率评估了各化合物的校准灵敏度，结果显示灵敏度因分子结构而异，藏红花素II和藏红花素III的灵敏度相对较低，而藏红花酸的灵敏度最高。藏红花素及其衍生物在密蒙花材料中的质谱检测限（LOD）范围为0.25至2 ng/mL，定量限（LOQ）范围为2至5 ng/mL，表明该方法具有很高的灵敏度。稳定性测试结果显示，除藏红花素II iso-2的RSD为16.04%外，其余所有被测化合物的RSD均低于15%。日内精密度（重复性）结果显示，除藏红花素II（RSD=7.87%）和藏红花素III iso-2（RSD=6.41%）外，其余化合物的RSD均低于5%。日间精密度（重现性）结果显示，超过50%的内源性藏红花素及其衍生物的RSD低于15%，仅有4种低浓度藏红花素的RSD低于20%，表明该分析方法的精密度可以接受。藏红花素I和藏红花素II在两个加标水平下的方法回收率分别为[87.33%, 72.27%]和[117.49%, 92.13%]。

3.4 Quantitative profiling of crocins and their derivatives in Buddlejae flos, Gardenia fruit, and saffron

应用验证后的方法对密蒙花、栀子果实和藏红花样品中的藏红花素及其衍生物进行定量分析，揭示了一些有趣的发现：

1. 1.
   不同糖基数目的藏红花素及其衍生物在三者中的百分比组成差异巨大。密蒙花中以藏红花素IIIs最为丰富，占总量的87.8%；栀子果实中以藏红花素Is为主，占74.3%，其次是藏红花素IIIs，占17.4%；藏红花中也是藏红花素Is占比最高，为63.8%，其次是藏红花素IIIs（18.2%）和藏红花素IIs（15.3%）。
2. 2.
   藏红花中藏红花素及其衍生物的总含量显著高于密蒙花和栀子果实。
   这些不同的藏红花素谱图反映了不同来源（如密蒙花、栀子果实、藏红花）的UDP-葡萄糖基转移酶（UGTs）在催化藏红花素生物合成过程中可能存在的底物特异性差异。例如，先前研究发现藏红花中的CsUGT74AD1能够催化从藏红花酸生成藏红花素IV和V，而本氏烟（Nicotiana benthamiana）的UGTs主要参与藏红花素II及其异构体的生物合成。此外，栀子中的GjUGT74F8和GjUGT94E13的协同作用可以产生五种类型的藏红花素，其中GjUGT94E13能够在体外催化藏红花素II或藏红花素IV转化为藏红花素I。

3.5 Quantitative profiling of crocins and their derivatives in yellow rice

验证后的方法也被用于分析用密蒙花染色的黄饭中的藏红花素及其衍生物。结果从黄饭中定量检测到17种藏红花素及其衍生物。所有被测藏红花素及其衍生物在黄饭中的含量均低于其在密蒙花原料中的含量。其中，藏红花素IIIs是黄饭中最主要的藏红花素（含量高达41 ng/mg鲜重），占黄饭中所有藏红花素及其衍生物总量的80%以上。黄饭中藏红花素的谱图特征与密蒙花相似，但总体含量较低。这表明在烹饪过程中，藏红花素从密蒙花转移到了米饭中，但可能存在损失或转化。

4 Conclusion

本研究成功建立了一种通过优化UHPLC色谱分离来消除源内裂解干扰的分析方法，结合高分辨Q-TOF MS，实现了对密蒙花中藏红花素及其衍生物的准确鉴定。优化后的色谱条件在40分钟内实现了所有目标化合物的基线分离，显著提高了其质谱响应信号。经验证，该方法能在单次进样中准确定量25种藏红花素及其衍生物。应用该方法揭示了密蒙花、栀子果实和藏红花在藏红花素组成上的显著差异，为理解不同来源UGTs的底物特异性及其在藏红花素生物合成中的作用提供了关键线索。同时，该方法成功应用于黄饭等食品基质中藏红花素的定量分析，为研究藏红花素作为营养组分和食用色素的功能奠定了基础。该开发的方法在扩展藏红花素天然资源、发现高效生物合成酶以及促进其在合成生物学中的潜在应用方面，是一个前景广阔的工具。