沙特阿拉伯哈伊勒省骆驼寄生璃眼蜱携带抗菌素耐药菌的研究及其公共卫生意义

《Frontiers in Veterinary Science》：Hyalomma dromedarii infesting camels in Hail Province, Saudi Arabia, carry antimicrobial resistant bacteria

本研究首次报道了沙特阿拉伯哈伊勒省骆驼寄生璃眼蜱（Hyalomma dromedarii）携带抗菌素耐药（AMR）细菌的流行情况。通过培养鉴定出阴沟肠杆菌复合体（Enterobacter cloacae complex）、施氏葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）等临床相关菌株，并利用Vitek 2 Compact系统完成药敏谱分析，发现其对头孢唑林、阿莫西林/克拉维酸等抗生素存在普遍耐药，为“One Health”框架下人畜共患病AMR风险监测提供了关键实证依据。

　　

引言

抗菌素耐药性（AMR）已成为全球重大的公共卫生挑战。AMR的蔓延使得许多常规抗生素疗法失效，进而导致多重耐药（MDR）细菌的出现，形成了耐药性发展的恶性循环。据2019年全球模型数据，抗菌素耐药性导致全球约495万人死亡，其中127万人直接死于耐药细菌感染。AMR细菌已在人类、动物、食品、植物以及水、土壤、空气等各种环境介质中被发现，并经常从其自然储存库传播给人类和动物，促进跨物种传播。

尽管大量研究调查了环境中AMR传播的各种模式，但关于节肢动物媒介传播AMR的文献有限。蜱是影响人类和动物的各种病原体的公认媒介，对公共卫生和兽医健康构成重大威胁。人类可感染多种蜱传细菌性疾病，例如由嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）引起的人粒细胞无形体病、莱姆病、由斑点热群立克次体引起的斑点热、由伯氏考克斯体（Coxiella burnetii）引起的Q热以及由土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）引起的土拉菌病。蜱微生物组的组成复杂，受到共生细菌、宿主和周围环境之间相互作用的塑造。在吸血过程中，蜱可以传播病原体和微生物，并可能促进AMR在宿主间的转移。鉴于其广泛的地理分布和寄生多种宿主（包括家畜、野生动物、候鸟和宠物）的能力，蜱越来越被认为是AMR传播的潜在储存库和媒介。尽管如此，大多数现有研究主要集中于蜱传病原体，往往忽视了与AMR传播相关的潜在公共卫生风险。此外，关于蜱种、寄生性与自由生活生命阶段以及代际传播对AMR分布和持久性的影响，人们仍然知之甚少。

本研究旨在调查寄生在骆驼（沙特阿拉伯主要牲畜物种）身上的蜱所携带细菌的流行率、多样性和潜在的AMR决定因素。尽管骆驼在区域粮食安全和兽医健康方面的重要性日益增长，但骆驼相关蜱作为AMR细菌储存库和媒介的作用仍不清楚。通过鉴定蜱种、分离细菌群落并描述抗菌素耐药性模式，本研究旨在描述骆驼蜱携带的细菌群落和抗菌素耐药性谱，从而为未来关注传播机制的研究提供基线。研究结果将有助于国家监测系统，为抗菌药物管理提供信息，并支持“One Health”框架内的针对性干预措施。最终，本研究旨在加强公众和动物健康，促进环境可持续性，并保护重要的自然资源。

材料与方法

研究区域选择

本研究在沙特阿拉伯西北部地区的哈伊市进行。哈伊以其独特的地形为特征，包括山脉、沙漠和肥沃的农业区，属于半干旱气候，与阿拉伯半岛其他地区相比降雨量适中。这些环境条件促进了作物种植和畜牧业，使哈伊成为农业和牧业活动的重要枢纽。该地区大量的骆驼种群以及频繁的人畜互动，为研究蜱传细菌病原体提供了理想的环境。

蜱的采集与鉴定

在10月和11月期间，从沙特阿拉伯哈伊市20英里半径范围内的多个地点共采集了57只蜱。标本是在哈伊骆驼市场从13头母驼身上手动获取的，目标部位是偏好的附着点，如肛周区域、乳房和大腿内侧。每只标本均使用尖头镊子小心取下，并立即放入带有穿孔盖子的无菌20毫升塑料容器中，以确保充分通风。

采集后，蜱在相对湿度70%至93%、温度20至26°C的受控条件下保存以维持其活力。在处理时进行了活力评估，并记录了显著的生物学观察结果，如饱血雌蜱的产卵现象。

通过形态学鉴定，使用立体显微镜详细检查结构特征，并采用基于外部形态、发育阶段和性别特异性特征的分类学钥匙进行。通过靶向线粒体16S rRNA基因的分子鉴定进一步确认物种。使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit按照制造商说明提取基因组DNA。使用Black和Piesman描述的引物扩增16S rRNA基因的部分片段：正向5′-CTGCTCAATGATTTTTAAATTGCTGTGG-3′和反向5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′。PCR扩增在20微升反应体积中进行，采用经Mangold等人修改的热循环条件：94°C初始变性3分钟，随后进行35个循环（94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分钟），最后在72°C延伸5分钟。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳观察，并使用商业凝胶回收试剂盒纯化。纯化的扩增子送至Macrogen, Inc.进行双向测序。

从蜱中分离细菌

从骆驼身上采集的蜱经过多个步骤处理以确保有效的细菌分离。首先，将每只蜱浸入70%乙醇中5分钟进行表面消毒，随后用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗三次以去除外部污染物。然后在无菌条件下提取内部组织。蜱组织匀浆在II级生物安全柜内进行。整个过程使用无菌一次性手套、实验服和口罩。所有仪器在使用前均经过灭菌，并使用无菌PBS。由于设备限制，采用手动玻璃匀浆器手动匀浆蜱组织，但始终确保无菌操作。将所得匀浆转移至营养肉汤中进行富集，并在37°C培养箱中以250转/分钟的恒定转速振荡培养24小时。富集后，将样品接种在血琼脂和麦康凯琼脂平板上，以促进多种细菌物种的生长。所有培养基和肉汤均按照标准微生物学方案制备。培养基在使用前于121°C、15 psi下高压灭菌15分钟。血琼脂平板通过在无菌条件下向灭菌的基础琼脂中添加5%脱纤维绵羊血制备。接种后，平板在37°C下培养24小时。次日，根据菌落形态和色素沉着挑选单菌落。最后，将细菌分离物在-80°C甘油 stocks中保存以备进一步分析。

细菌分离物的鉴定

对于细菌鉴定，分离的微生物使用革兰氏染色技术区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏染色后，使用生物梅里埃Vitek 2 Compact系统进行鉴定和抗菌药物敏感性试验。使用BioMérieux Vitek 2 Compact系统，分别采用革兰氏阳性（GP）ID卡REF21342和革兰氏阴性（GN）ID卡REF21341，按照制造商指南操作。

抗菌药物敏感性试验

使用Vitek 2 Compact系统对29株细菌分离物进行抗菌药物敏感性试验。通过专用卡片，AST-N417用于GN，AST-P580用于GP，该系统测定各种抗生素对细菌的最低抑菌浓度（MIC）。测试的抗生素代表了针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的多个类别。用于革兰氏阳性菌的抗生素包括：苄青霉素（benzylpenicillin）、苯唑西林（oxacillin）、庆大霉素（gentamicin）、妥布霉素（tobramycin）、左氧氟沙星（levofloxacin）、莫西沙星（moxifloxacin）、红霉素（erythromycin）、克林霉素（clindamycin）、利奈唑胺（linezolid）、替考拉宁（teicoplanin）、万古霉素（vancomycin）、四环素（tetracycline）、替加环素（tigecycline）、呋喃妥因（nitrofurantoin）、夫西地酸（fusidic acid）、利福平（rifampicin）和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（trimethoprim/sulfamethoxazole）。用于革兰氏阴性菌的抗生素包括：阿莫西林/克拉维酸（amoxicillin/clavulanic acid）、哌拉西林/他唑巴坦（piperacillin/tazobactam）、头孢唑林（cefazolin）、头孢呋辛（cefuroxime）、头孢呋辛酯（cefuroxime axetil）、头孢他啶（ceftazidime）、头孢曲松（ceftriaxone）、头孢吡肟（cefepime）、厄他培南（ertapenem）、亚胺培南（imipenem）、美罗培南（meropenem）、阿米卡星（amikacin）、庆大霉素（gentamicin）、环丙沙星（ciprofloxacin）、磷霉素（fosfomycin）、呋喃妥因（nitrofurantoin）和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（trimethoprim/sulfamethoxazole）。分析后，使用MIC临界值来区分每个分离菌株对抗生素是敏感、中介还是耐药。结果通过Vitek 2 compact软件输出。

结果

从沙特阿拉伯哈伊勒省采集的硬蜱的收集与鉴定

从沙特阿拉伯哈伊勒省的13头母驼身上共采集了57只蜱。在此期间观察到的蜱负荷相对较低，这可能归因于当时较为凉爽的气候条件，因为较高的蜱密度通常与温暖的夏季月份相关。收集的蜱根据发育阶段和饱血状态分为三组：未饱血成虫（18只，31.6%）、饱血成虫（28只，49.1%）和若虫（11只，19.3%）。所有蜱在处理前均保持活力，并在数只饱血雌蜱中观察到产卵现象。为确认物种身份，通过靶向线粒体16S rRNA基因进行了分子鉴定。本研究生成的序列已存入GenBank，登录号为PV485260–PV485267。结果将所有标本鉴定为骆驼璃眼蜱（Hyalomma dromedarii），其进化关系如图所示。

从蜱中分离细菌的鉴定

从收集的蜱中，采用多种微生物培养技术，共分离出29株细菌。分离的细菌随后进行革兰氏染色，并使用Vitek 2 Compact系统进行菌株鉴定。结果显示，分离的细菌属于4个不同的物种。其中约79%（23株）为革兰氏阴性菌，21%（6株）为革兰氏阳性菌。高通量检测确定主要的革兰氏阳性菌为施氏葡萄球菌（Staphylococcus sciuri，4株），其次为木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，2株），这些菌株被报道为人类的潜在病原体。在革兰氏阴性菌中，最常见的物种是阴沟肠杆菌复合体（Enterobacter cloacae complex，21株），其次为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida，2株）。

分离细菌的抗菌药物敏感性测定

为确定这些细菌分离物的药物敏感性模式，使用Vitek 2 compact系统对所有29株细菌分离物进行了抗菌药物敏感性试验。结果显示，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均对多种抗菌药物表现出耐药性。

革兰氏阳性菌的抗菌药物适宜性试验结果如下：对于施氏葡萄球菌，100%（4/4）对夫西地酸耐药，33.3%（2/4）对苄青霉素耐药，16.7%（1/4）对红霉素耐药。约50%（2/4）的该分离株对莫西沙星和克林霉素表现出中介耐药。100%（4/4）的施氏葡萄球菌对苯唑西林、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素、四环素、替加环素、呋喃妥因、利福平和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑敏感。另一种物种，木糖葡萄球菌，显示出100%（2/2）对夫西地酸耐药，100%（2/2）对苯唑西林、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素、四环素、替加环素、呋喃妥因、利福平和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑敏感。

对于革兰氏阴性菌，抗菌药物敏感性试验结果如下：阴沟肠杆菌复合体对阿莫西林/克拉维酸和头孢唑林显示出100%（21/21）的耐药率。该分离株对三种抗生素表现出中介耐药，包括100%（21/21）对头孢呋辛和头孢呋辛酯中介，95%（20/21）对呋喃妥因中介，以及4.7%（1/21）对磷霉素中介。约100%（21/21）的该分离株对哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑敏感。另一种物种，恶臭假单胞菌，显示出100%（2/2）对头孢唑林和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐药，100%（2/2）对哌拉西林/他唑巴坦中介，以及50%（1/2）对头孢曲松中介。100%（2/2）的该分离株对其他抗菌药物敏感，包括阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢他啶、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、磷霉素和呋喃妥因。本研究中强调的每种细菌的抗生素敏感性见表。

讨论

AMR问题日益影响人类健康，其驱动因素包括临床和农业中抗生素的广泛使用，以及环境中抗生素的积累。蜱是多种人畜共患病的已知媒介，携带复杂多样的微生物群。多种因素，包括蜱种、地理位置、环境条件、饱血状态和生命阶段，都可能影响该微生物群的组成。然而，蜱作为AMR潜在储存库的作用是一个新兴的研究领域。在本研究中，我们调查了沙特阿拉伯哈伊勒省骆驼蜱的微生物多样性，并报道了其中存在抗菌素耐药细菌。

本研究从骆驼蜱中鉴定出几种临床相关细菌物种，包括阴沟肠杆菌复合体、施氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌和恶臭假单胞菌。虽然这些物种传统上不被归类为蜱传病原体，但其中一些物种可能与人类和动物的机会性感染有关。例如，阴沟肠杆菌经常在医院获得性感染中被报道，并且已知携带多种耐药机制。施氏葡萄球菌已从伤口和尿路感染中分离出来，并被认为是抗菌素耐药基因的储存库。在骆驼璃眼蜱中检测到这些物种表明，骆驼蜱可能充当环境或机会性病原体的偶然携带者。这引发了关于AMR细菌在蜱种群内获得和潜在传播的重要问题。

尽管尚不清楚这些细菌是蜱微生物群的永久成员，还是从环境或宿主获得的短暂污染物，但先前的研究已报道过类似的菌属。环境条件、地理位置和宿主暴露可能影响与蜱相关的微生物群落。观察到的耐药模式可能反映了骆驼伤口处理中间接接触抗生素的情况；然而，本研究缺乏正式的兽医治疗记录，限制了得出明确结论的能力。

因此，骆驼璃眼蜱携带的真正细菌多样性可能比本研究捕获的更广泛。此外，选择哈伊勒省作为研究区域可能影响了观察到的微生物组成，考虑到其半干旱气候、高骆驼密度和频繁的人畜互动。这些生态和人为因素可能有助于蜱对环境获得性AMR细菌的获取和潜在传播。未来采用高通量方法（如16S rRNA扩增子测序或宏基因组学）的研究将需要捕获蜱种群更广泛的微生物多样性。

先前在沙特阿拉伯焦夫省进行的一项研究描述了骆驼蜱的微生物群，并报道了缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）、假中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius）和少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）的优势存在。相比之下，我们的研究未在分析的蜱样本中检测到这些细菌物种。有趣的是，我们观察到阴沟肠杆菌复合体的显著流行率，这可能归因于影响微生物多样性的地理变异。此外，与早期研究不同，我们未发现任何细菌分离株对苄青霉素、苯唑西林、克林霉素或万古霉素的杀菌作用产生完全耐药性。观察到的中介耐药表型，例如阴沟肠杆菌对头孢呋辛的中介，可能反映了固有的变异性，并不一定预示临床治疗失败。因此，在考虑其流行病学和临床相关性时应谨慎解释这些发现。

我们认为这种差异可能由地理拓扑和样本采集时间的差异解释，这些因素已知会影响AMR细菌的分布。此外，来自不同地区的多项关于蜱微生物组的研究表明，蜱的地理位置在塑造其微生物组方面起着至关重要的作用。或者，有研究表明吸血改变了蜱微生物组的多样性，并可能降低蜱体内的微生物丰度。因此，我们不能排除所研究蜱的生命周期和摄食阶段可能导致观察到的微生物多样性差异的可能性。

总的来说，我们的研究强调了由蜱介导的抗菌素耐药性的复杂动态。虽然我们在沙特阿拉伯哈伊勒省的蜱种群中发现了抗菌素耐药性细菌病原体的存在，但驱动这种耐药性的潜在机制仍不清楚。抗生素耐药基因（ARGs）越来越被认为是新兴的环境污染物，因为它们具有在细菌物种和生态系统之间水平转移的潜力，从而促进了多重耐药细菌的出现和传播。因此，我们假设这些耐药细菌携带赋予抗菌素耐药性的ARGs，尽管其具体身份和作用尚未阐明。此外，ARGs很可能是通过遗传垂直传播，或通过可移动遗传元件（MGEs）水平传播，从而促进耐药性状在细菌种群中的传播。

局限性

本研究存在若干局限性。首先，虽然表征了抗菌素耐药性表型，但未在分子水平上确认特定耐药基因的存在或可移动性，应在未来研究中加以调查。其次，依赖基于培养的方法可能选择性偏好快速生长的物种，而忽略了苛养菌或胞内菌（如立克次体、考克斯体、无形体）。这种依赖性可能导致蜱微生物组的不完整表征。因此，未来研究应结合高通量方法，如16S rRNA基因测序或宏基因组学方法，以捕获更广泛、更全面的微生物谱。第三，地理上集中于哈伊勒省可能限制研究结果的普适性，因为细菌多样性和耐药谱可能存在区域差异。最后，横断面设计无法得出关于耐药性时间动态的结论。在未来研究中解决这些局限性将为蜱作为抗菌素耐药细菌储存库和传播者的作用提供更深入的见解。