木瓜叶绿体基因组比较分析揭示进化关系与高效分子标记开发

《Frontiers in Plant Science》：Comparative analysis of chloroplast genomes in Carica species reveals evolutionary relationships of papaya and the development of efficient molecular markers

本研究通过比较17个木瓜品种的叶绿体基因组，系统解析了其保守的四分区结构（含131个功能基因）和进化关系，发现两个主要进化枝。研究鉴定出高变非编码区并开发出三组高分辨率分子标记（trnG–trnR、rbcL–accD和rpl12–rps19），可精准区分关键育种系（如YZ1与Tainong），为木瓜种质创新和标记辅助育种提供了可靠工具。该成果填补了木瓜叶绿体基因组研究空白，对热带果树 chloroplast resources 研究具有重要参考价值。

　　

1 引言

木瓜作为"三大热带草本果树"之一，因单一种植和种间杂交障碍导致遗传多样性受限，严重影响其产量与抗病性。虽然核基因组研究较为深入，但叶绿体基因组研究仍存在空白。叶绿体基因组因其母系遗传、适中进化速率和结构保守性，成为系统发育分析和分子标记开发的理想工具。本研究旨在通过分析17个木瓜品种的叶绿体基因组，揭示其进化关系并开发高效分子标记。

2 结果

2.1 叶绿体基因组组装与注释

通过Illumina测序获得17个木瓜品种的完整叶绿体基因组，分为两种类型：Type1（160,084 bp）包含8个品种，Type2（160,100 bp）包含9个品种。基因组均呈现典型四分区结构，注释获得78个独特蛋白编码基因、29个tRNA基因和4个rRNA基因。两种类型在基因含量和拷贝数上无差异。

2.2 密码子使用偏好

对78个蛋白编码基因的密码子使用分析显示，木瓜叶绿体基因组普遍存在使用偏好。亮氨酸密码子UUA表现出最强偏好性（RSCU值达1.98），这与叶绿体基因组低GC含量特征相符。起始密码子AUG和色氨酸密码子UGG因无同义密码子而保持RSCU值为1.00。

2.3 重复序列分析

Type1和Type2基因组分别检测到99和103个SSR，均以单核苷酸和二核苷酸重复为主。分散重复序列分析显示两者具有相似的重复类型分布，最大回文重复长度均为26,325 bp，表明基因组结构高度保守。

2.4 系统发育分析

基于完整叶绿体基因组和78个共享蛋白编码基因构建的最大似然树清晰分为两个主要进化枝，与APG分类系统一致。Type1和Type2品种分别形成独立分支，支持其遗传分化。

2.5 IR区扩张/收缩分析

IR边界分析发现7个基因位于边界区域，其中rps19和ycf1在所有品种中均呈现保守的跨边界结构。Type2基因组在IRb/SSC边界存在16 bp特异性扩张，这是由于ycf1基因向IRb区延伸更深所致。

2.6 核苷酸多样性分析

滑动窗口分析显示IR区绝对保守，SSC区变异最显著。鉴定出4个高变区域（ccsA–ndhD、ndhD、psaC和ycf1），其中ccsA–ndhD间隔区多态性最高（Pi=0.01324）。mVISTA比对证实非编码区序列差异更大。

2.7 共线性分析

全基因组比对显示17个品种具有近乎完美的共线性，仅存在边界区域的微细变异。系统发育树与共线性模式高度一致，表明叶绿体基因组结构稳定性是木瓜进化的重要特征。

2.8 分子标记开发

基于高变非编码区开发了三组分子标记，通过PCR扩增和Sanger测序验证，成功区分YZ1、Tainong和Daqing等关键育种材料。标记扩增片段大小在100-500 bp之间，为品种鉴定提供了实用工具。

3 讨论

3.1 保守叶绿体基因组中的进化驱动力

木瓜叶绿体基因组的高度保守性与其驯化过程中的遗传瓶颈有关。边界动态变化基因ycf1作为叶绿体TIC复合体的跨膜亚基，可能通过调节防御和应激反应在环境适应性中发挥重要作用。

3.2 分子标记在育种中的应用潜力

开发的分子标记能100%准确区分抗病和感病品种，特别是Tainong和YZ1进化枝。然而，叶绿体基因组低多样性可能限制其对复杂农艺性状的分辨能力，需要与核基因组标记结合使用。

3.3 遗传多样性解析的局限性

研究主要集中于栽培品种，对野生资源的涵盖不足可能低估了属内天然遗传多样性。叶绿体基因组与线粒体、核基因组的互作关系仍需进一步探索。

3.4 基因组见解向应用的转化

未来研究应聚焦多基因组层面构建系统发育网络，利用基因编辑技术验证ycf1功能，开发叶绿体-核基因组混合标记面板。针对木瓜环斑病毒等主要病害，分子标记将加速抗病品种选育进程。

4 方法

实验材料来自中国三亚崖州区和中国热带农业科学院种质资源圃。采用CTAB法提取DNA，使用GetOrganelle进行基因组组装，CPGAVAS2进行注释。系统发育分析采用MAFFT、MEGA等软件，分子标记通过Primer-BLAST设计并经实验验证。