GSDMD缺陷型G-MDSCs通过增强免疫抑制活性缓解MPTP诱导的帕金森病

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：GSDMD-Deficient G-MDSCs Exert Profoundly Suppressive Activity to Relieve MPTP-Induced Parkinson's Disease

本文揭示了GSDMD缺陷可增强粒细胞样髓源抑制细胞（G-MDSCs）的免疫抑制功能，从而通过抑制小胶质细胞活化和神经炎症来缓解MP金森病（PD）进展。研究通过基因敲除小鼠模型和过继转移实验证实，靶向GSDMD调控MDSCs功能为PD治疗提供了新策略。NLRP3抑制剂ACT001可通过上调G-MDSCs活性发挥协同治疗作用。

　　

ABSTRACT

Aims

髓源抑制细胞（MDSCs）在帕金森病（PD）患者中升高，但其功能作用尚不清楚。本研究探讨GSDMD缺陷是否通过增强粒细胞样MDSCs（G-MDSCs）的免疫抑制活性来缓解PD进展。

Methods

通过流式细胞术和蛋白质印迹分析37例PD患者和21例对照者外周血中的G/M-MDSCs。采用MPTP诱导的PD小鼠模型，通过行为学测试、免疫组化和过继转移实验评估GSDMD缺陷型G-MDSCs的作用。同时评价NLRP3抑制剂ACT001的治疗潜力。

Results

PD患者和MPTP处理小鼠的外周血G-MDSCs增加且NLRP3/GSDMD活化降低。GSDMD基因敲除（KO）小鼠的PD症状减轻，该保护效应可被MDSCs清除所逆转。过继转移GSDMD缺陷型G-MDSCs可抑制小胶质细胞活化并改善运动功能。ACT001通过增强G-MDSCs的免疫抑制能力减轻PD病理。

Conclusion

GSDMD缺陷促进免疫抑制性G-MDSCs的生成，进而抑制神经炎症和PD进展。靶向GSDMD调控MDSCs功能为PD治疗提供了新策略。

1 Introduction

帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，以运动症状（包括运动迟缓、强直和震颤）及其他非运动障碍为特征。典型病理变化包括黑质（SN）多巴胺能神经元丢失和纹状体多巴胺浓度降低，并伴有α-突触核蛋白包涵体（路易体或路易神经突）的出现。异常免疫功能和炎症已被证实参与PD发病，表现为肠道菌群失调和肠道炎症、外周血促炎性T细胞/巨噬细胞/细胞因子增加、血脑屏障（BBB）通透性增加伴外周细胞浸润中枢神经系统（CNS）、以及小胶质细胞活化和促炎细胞因子介导的慢性神经炎症。因此，开发调控免疫功能的新制剂可通过抑制炎症延缓PD进展。

髓源抑制细胞（MDSCs）是一类具有免疫抑制作用的未成熟髓系细胞异质性群体，在慢性炎症和肿瘤进展中大量扩增。在持续生长因子和炎症介质作用下，中性粒细胞和单核细胞呈现未成熟表型，即粒细胞样MDSCs（G-MDSCs）和单核细胞样MDSCs（M-MDSCs）。两类MDSCs均具有弱吞噬活性，高表达死亡受体5（DR5）、程序性死亡配体1（PD-L1）、活性氧（ROS）、一氧化氮、精氨酸酶（ARG1）、前列腺素E2及抗炎细胞因子（IL-10和TGF-β1），可抑制效应T细胞和促炎巨噬细胞活性并增强调节性T细胞功能。PD患者外周血MDSCs增加，但其在PD进展中的作用尚不明确。

GSDMD活化是炎症小体激活的终末事件，导致细胞焦亡及IL-1β和IL-18释放。鉴于GSDMD广泛存在于免疫细胞和实质细胞中，其活化必然加剧局部炎症。然而，GSDMD在MDSCs或Treg等免疫抑制细胞中的异常表达或活化尚未阐明。作者前期发现GSDMD^?/?小鼠G-MDSCs显著增加，本研究旨在探讨GSDMD缺陷型G-MDSCs是否通过发挥免疫抑制活性限制PD进展。

2 Materials and Methods

2.1 Patients

招募37例PD患者采集外周血，所有患者依据《运动障碍学会PD临床诊断标准（2015版）》诊断。样本采集符合苏北人民医院伦理要求（批号2024ky080），所有参与者均签署知情同意书。

2.2 Mice and PD Model

采用GSDMD基因敲除（KO）小鼠（GSDMD^?/?）、GSDMD^flox/flox小鼠和S100A8^cre小鼠（C57BL/6背景）。将GSDMD^flox/flox小鼠与S100A8^cre小鼠杂交，获得髓系细胞特异性GSDMD条件性敲除（cKO）小鼠。动物实验遵循中国《实验动物护理和使用指南》，并经扬州大学医学院伦理委员会批准（YXYLL-2020-67）。

采用MPTP建立亚急性PD小鼠模型。12周龄雌雄小鼠（体重25±2 g，性别比例均衡）腹腔注射MPTP（30 mg/kg/次），连续7天。注射过程在通风橱内进行以确保安全。

2.3 Reagents and Antibodies

实验所用抗体及试剂包括：α-突触核蛋白、GSDMD、NLRP3、caspase-1、cleaved GSDMD、IL-1β、Arginase-1等（Cell Signaling Technology）；TH、TNF-α、IL-6（Servicebio）；Iba1（Abcam）；抗小鼠DR5（BioXCell）；流式抗体（BioLegend）；MPTP和ACT001（MedChemExpress）；LPS（Sigma-Aldrich）。

2.4 Behavioral Experiments

2.4.1 Rotarod Test

通过旋转棒装置评估小鼠运动协调性。给药前所有小鼠在5-30 rpm转速下训练300秒，训练次数≥3次以确保适应。MPTP处理后以相同条件测试，记录跌落潜伏期。

2.4.2 Open-Field Test

采用黑色塑料箱（40 cm×40 cm×40 cm）进行旷场实验。测试前小鼠适应环境30分钟，记录5分钟内运动轨迹、静止时间和嗅探等精细运动。

2.5 Immunohistochemistry

切片经抗原修复后，用过氧化物酶阻断内源性酶活性，依次孵育非特异性染色阻断剂、一抗和二抗，DAB溶液显色，苏木精复染。结果通过Nikon Eclipse 80i显微镜采集。

2.6 Immunofluorescence

组织OCT包埋后切片（25 μm），5% BSA和0.3% Triton X-100封闭，依次孵育一抗、二抗，DAPI复染核。荧光结果通过Zeiss AxioScope 5采集。

2.7 Western Blot

组织或细胞裂解离心后取上清，SDS-PAGE分离蛋白并转至PVDF膜，封闭后依次孵育一抗、二抗，化学发光法检测条带。

2.8 Isolation of Single Cells

组织无菌分离剪碎后，0.125%胰酶37°C消化，离心获得单细胞，接种于T75培养瓶，DMEM/F-12培养基（含1%双抗和10% FBS）中37°C、5% CO₂培养。

2.9 Flow Cytometry

细胞荧光标记后通过BD FACSVerse分析。胞内细胞因子检测时，细胞先经高尔基体阻断剂处理，表面抗体染色后固定、破膜，孵育胞内检测抗体。

2.10 Statistics

数据通过GraphPad Prism分析，正态分布数据以均值±SEM表示。两组比较采用非配对t检验，多组比较采用单因素ANOVA与Tukey事后检验。显著性标记为p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001。

3 Results

3.1 Increased G-MDSCs in the Periphery of Individuals With PD

首先检测PD患者和健康对照外周血中G-MDSCs（HLA-DR^?CD11b⁺CD33^low）和M-MDSCs（HLA-DR^?CD11b⁺CD33^high）分布。PD患者外周血G-MDSCs和M-MDSCs均增加，其中G-MDSCs升高尤为显著。这些MDSCs高表达DR5、PD-L1、IL-10和TGF-β1。比较MPTP诱导PD小鼠与正常小鼠脑和脾脏G/M-MDSCs发现：PD小鼠脑和脾脏MDSCs均增加，但脾脏G-MDSCs升高而脑内降低；脾脏M-MDSCs降低而脑内升高。鉴于M-MDSCs在炎症条件下的可塑性，本研究聚焦G-MDSCs在PD进展中的作用。

尽管PD小鼠脑内G-MDSCs数量减少，但这些细胞高表达TGF-β1、IL-10和PD-L1，而脾脏G-MDSCs无此变化。脑内G-MDSCs线粒体ROS（mROS）和细胞ROS（cROS）水平升高，脾脏G-MDSCs则降低。脑内G-MDSCs胞内IL-1β增加，脾脏则降低。PD患者外周血G-MDSCs中NLRP3、cleaved-caspase 1、cleaved-GSDMD和IL-1β表达降低。脾脏G-MDSCs同样低表达NLRP3、cleaved caspase 1、IL-1β和cleaved GSDMD。结果表明PD个体外周G-MDSCs增加且GSDMD活化降低。

3.2 Amelioration of MPTP-Induced PD in GSDMD^?/? Mice by G-MDSCs

MPTP处理GSDMD-KO和野生型（WT）小鼠后行为学分析显示：KO小鼠行为障碍较WT小鼠减轻，表现为旷场实验运动轨迹改善、静止时间缩短、嗅探次数增加，旋转棒实验停留时间延长。MPTP处理后，KO小鼠黑质和纹状体酪氨酸羟化酶（TH）丢失减少，α-突触核蛋白、TNF-α和IL-6生成降低。免疫组化证实KO小鼠黑质和纹状体小胶质细胞（IBA1）TNF-α表达减少。caspase1^?/?小鼠MDSCs无显著变化，其旷场行为与WT小鼠相似。

进一步检测脑内MDSCs分布发现：GSDMD^?/?小鼠脑内MDSCs显著增加，其中G-MDSCs升高明显，且高表达PD-L1和TGF-β1（IL-10无变化）。采用DR5抗体清除GSDMD^?/?小鼠MDSCs后，其运动能力急剧下降至MPTP处理WT小鼠水平，旋转棒实验平均速度恢复。清除MDSCs后，KO小鼠黑质和纹状体TH表达显著下调。结果表明GSDMD^?/?小鼠对MPTP诱导PD的缓解作用依赖于G-MDSCs。

3.3 Alleviation of MPTP-Induced PD in GSDMD^flox/flox-S100A8^cre Mice

通过S100A8^cre小鼠构建髓系细胞特异性GSDMD条件性敲除（cKO）小鼠。与KO小鼠类似，cKO小鼠经MPTP处理后PD严重程度较轻，表现为旷场实验运动轨迹改善、静止时间缩短，旋转棒停留时间延长。相较于GSDMD^flox小鼠，MPTP处理的cKO小鼠黑质和纹状体TH保留更多，TNF-α和IL-6生成减少。免疫组化显示cKO小鼠黑质和纹状体TNF-α和IL-6染色强度显著低于GSDMD^flox小鼠。结果证实GSDMD^?/? MDSCs对PD进展具有保护作用。

3.4 Adoptive Transfer of GSDMD^?/? G-MDSCs Limiting PD Progression

分离WT和KO小鼠CD11b⁺GR1⁺细胞过继转移至MPTP处理的WT小鼠。正常或GSDMD缺陷MDSCs输注均能增强PD小鼠运动能力，且MDSCs^KO效果优于MDSCs^WT。旷场实验静止时间和旋转棒停留时间进一步证实MDSCs^KO缓解PD症状更有效。Western blot显示MDSCs^KO输注组黑质和纹状体TH丢失更少、TNF-α生成更低。组织学分析表明MDSCs^KO输注可促进黑质和纹状体TH恢复、减少小胶质细胞阿米巴样形态、降低TNF-α染色强度。结果表明输注GSDMD^?/? MDSCs可有效抑制MPTP诱导的PD。

3.5 GSDMD^?/? G-MDSC Inhibition of Inflammatory Activity of Microglia Ex Vivo

鉴于PD与慢性炎症相关，过度活化的小胶质细胞对多巴胺能神经元具有损害作用。分析G-MDSCs对LPS刺激的BV2细胞（小胶质细胞系）促炎细胞因子生成的影响发现：当G-MDSCs^KO与BV2细胞共培养时，后者TNF-α、IL-6和IL-1β分泌减少，尤其在5:1比例时效果显著。分离WT或KO小鼠原代小胶质细胞，经LPS刺激后与GSDMD^?/? G-MDSCs共培养，结果显示GSDMD^?/? G-MDSCs可有效抑制小胶质细胞TNF-α和IL-6生成。表明GSDMD^?/? G-MDSCs具有显著抑制LPS刺激小胶质细胞炎症活性的能力。

3.6 ACT001 Protection Against PD via Upregulating G-MDSC Activities

ACT001（二甲氨基米芝果内酯富马酸盐）可通过下调NLRP3炎症小体激活抑制MPTP诱导的α-突触核蛋白积累、小胶质细胞/星形胶质细胞活化及多巴胺能神经退行性变。本研究探讨ACT001是否影响G-MDSCs活性。CCK-8法测定ACT001对G-MDSCs的半抑制浓度（IC50）为32.8 μM。ACT001处理可剂量依赖性降低G-MDSCs中NLRP3、GSDMD和IL-1β表达，增加ARG1生成。ACT001直接诱导G-MDSCs（而非M-MDSCs）扩增，并降低IL-1β、升高TGF-β1表达。

行为学实验证实ACT001可改善MPTP诱导PD小鼠的运动能力和平衡能力。组织学分析显示ACT001注射组黑质和纹状体TH染色增强，Western blot进一步证实TH水平升高。ACT001处理的PD小鼠脑内G-MDSCs增加（M-MDSCs无变化），且这些G-MDSCs可产生TGF-β1发挥免疫抑制效应。表明ACT001对PD的改善作用涉及G-MDSCs活性上调。

4 Discussion

MDSCs参与PD进展已被报道，增强其免疫调节活性理论上可抑制这一炎症相关慢性疾病。本研究显示PD患者和小鼠外周G-MDSCs增加而CNS中减少，且外周G-MDSCs的NLRP3/GSDMD炎症小体活化降低。全身性或髓系细胞特异性GSDMD缺陷小鼠PD症状减轻，且该保护效应可被MDSCs清除所逆转。过继转移GSDMD缺陷型G-MDSCs可直接抑制PD进展，并在体外有效抑制小胶质细胞促炎活性。NLRP3抑制剂ACT001可通过诱导G-MDSCs发挥保护作用。综上，调控GSDMD缺陷型G-MDSCs的过继转移或体内抑制MDSCs的GSDMD活化可用于治疗炎症相关疾病。

PD患者外周血G-MDSCs增加，PD小鼠脾脏G-MDSCs升高而脑内降低。尽管脑内G-MDSCs数量少，但其高表达TGF-β1、IL-10和PD-L1，提示具有免疫抑制活性。脾脏G-MDSCs的NLRP3/GSDMD活化降低伴数量增加，表明抑制GSDMD活化可促进G-MDSCs诱导。同时，PD小鼠CNS炎症微环境中脑内G-MDSCs的mROS和胞内IL-1β增加，提示GSDMD活化度高，进一步说明局部炎症下GSDMD高活化不利于G-MDSCs诱导。

本研究在既往发现GSDMD缺陷抑制PD模型神经炎症的基础上，进一步阐明GSDMD缺陷型G-MDSCs的免疫调节作用。尾静脉过继转移GSDMD^?/? G-MDSCs可有效抑制PD进展。尽管未观察到输注G-MDSCs进入CNS，但其免疫抑制效应可能通过减轻外周炎症间接缓解CNS炎症。此外，G-MDSCs来源的TGF-β1可能通过通透性增加的BBB发挥免疫调节作用。

小胶质细胞作为CNS主要免疫细胞，在神经退行性疾病发病中起关键作用。有证据表明外周感染可触发外周髓系细胞焦亡，进而启动小胶质细胞免疫训练，促进神经炎症和PD样症状。本研究虽未直接评估小胶质细胞免疫记忆，但发现GSDMD^?/? G-MDSCs高表达TGF-β1和IL-10、低表达IL-1β和TNF-α，这些细胞因子可通过影响NF-κB和STAT3等转录因子调控小胶质细胞免疫状态及基因表达谱，提示其可能调节小胶质细胞免疫记忆。

GSDMD缺失诱导G-MDSCs的分子机制与线粒体膜GSDMD缺失减少细胞凋亡和线粒体DNA释放有关，从而抑制cGAS/Sting激活，降低IRF7/8表达，促进髓系细胞向G-MDSCs分化。双硫仑可通过直接抑制GSDMD活化诱导G-MDSCs，但其应用受饮酒影响严重。GSDMD抑制剂的治疗前景需平衡获益与风险，关键在于实现病理微环境特异性调控而非全身抑制。

ACT001因不良反应小、BBB通透性高，有望用于胶质瘤和PD治疗。其机制包括通过抑制AKT磷酸化阻断NF-κB核转位，进而抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体通路激活。ACT001对PD具有双重保护作用：直接抑制促炎细胞（如小胶质细胞）炎症小体活化，以及诱导免疫抑制细胞（MDSCs）。短期ACT001给药可抑制神经炎症，但长期给药可能产生自身免疫倾向等副作用，需进一步临床验证。

5 Conclusion

本研究证实G-MDSCs参与PD进展，GSDMD缺陷可通过增加G-MDSCs缓解MPTP诱导的PD。髓系细胞特异性GSDMD敲除小鼠PD症状减轻，过继转移GSDMD缺陷型G-MDSCs可有效缓解PD进展。ACT001对PD小鼠的保护作用伴随脑内G-MDSCs增加。因此，干扰GSDMD活化以增强G-MDSCs免疫抑制活性可作为PD治疗新策略。