多重PCR检测α-珠蛋白基因常见突变在α-地中海贫血诊断中的效用评估

《Anemia》：Diagnostic Utility of a Multiplex PCR Assay in Detecting Common Mutations of the α-Globin Gene in α-Thalassemia

本综述系统评估了多重PCR（multiplex PCR）技术在α-地中海贫血（α-thalassemia）常见突变检测中的诊断价值。研究通过优化三管多重PCR体系，实现了对--SEA、-α3.7、αCSα等9种常见突变的高效检测，在泰国和韩国人群样本中验证显示与MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification）和Sanger测序结果高度一致（吻合率99.92%-100%）。该方法具有快速、低成本、操作简便等优势，为α-地中海贫血的群体筛查和临床诊断提供了可靠工具。

　　

引言

α-地中海贫血（α-thalassemia）是一种常见的遗传性血红蛋白病，其特征是α-珠蛋白链合成减少或缺失。正常个体每个染色体携带两个α-珠蛋白基因，疾病的严重程度与受影响等位基因的数量相关。单个α-珠蛋白基因缺失的个体为无症状携带者，两个基因缺失表现为α-地中海贫血特征，三个基因失活导致血红蛋白H病（Hb H disease），而四个α-珠蛋白基因全部缺失则引发最严重的Hb Bart's水肿胎综合征（Hb Bart’s hydrops fetalis syndrome），常导致胎儿出生后死亡。α-地中海贫血的病因主要包括缺失性突变和非缺失性突变，其中--^SEA、--^FIL、--^THAI等缺失类型在东南亚地区常见，而Hb Constant Spring（Hb CS）和Hb Paksé（Hb PS）等非缺失性突变则通过影响终止密码子导致α链延长和血红蛋白不稳定。

材料与方法

研究收集了2017年至2022年期间的2121份样本，包括来自泰国的1261例基因组DNA样本、韩国本地人群的300例样本以及居住在韩国的不同族裔人群的560例样本。DNA提取使用QIAamp DNA Blood Mini Kit，并通过NanodropOne检测纯度。研究优化了多重PCR体系，将其分为三组试剂盒（Kit A、B、C），分别针对不同的突变类型。Kit A检测--^SEA、--^FIL和--^THAI缺失；Kit B检测-α^3.7、-α^4.2、--^20.5和--^MED缺失，并以ABL1基因作为内参；Kit C检测Hb CS和Hb PS非缺失性突变。PCR反应条件包括95°C初始活化15分钟，随后35个循环的95°C 1分钟、65°C 1分钟和72°C 2分钟30秒，最终72°C延伸10分钟。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分析。同时，研究使用MLPA试剂盒P140-C1 HBA和Sanger测序作为对照方法，验证多重PCR结果的准确性。

结果

在泰国样本中，α-珠蛋白基因突变等位基因的总检出率为33.7%（851/2522），其中-α^3.7缺失最为常见（18.6%），其次是--^SEA缺失（7.9%）和α^CSα突变（5.6%）。新开发的多重PCR试剂盒与泰国本地试剂盒的总体一致率达到99.92%，仅一例复合杂合子（-α^3.7/-α^4.2）存在差异。在韩国外籍人群样本中，5.89%（33/560）被鉴定为α-地中海贫血健康携带者，其中-α^3.7缺失型占比最高（3.93%），而所有韩国本地样本均未检出突变。血液学参数分析显示，--^SEA缺失携带者的血红蛋白（Hb）、平均红细胞体积（MCV）和平均血红蛋白含量（MCH）异常比例显著高于-α^3.7缺失携带者，提示--^SEA缺失的临床影响更为显著。

MLPA和Sanger测序验证结果显示，新开发的多重PCR方法在所有突变类型中的检测灵敏度为98.9%-100%，特异性均为100%。Cohen's kappa一致性分析表明，除-α^3.7缺失的kappa值为0.996外，其余突变类型的kappa值均为1.0。此外，研究还发现--^SEA缺失的断点位置（chr16: c.165397–c.184700）与部分数据库记录存在差异，提示地区特异性突变需在诊断中加以注意。

讨论

本研究成功开发了一种快速、经济、操作简便的多重PCR方法，用于α-地中海贫血的常见突变检测。与传统MLPA和Sanger测序相比，该方法在保持高准确性的同时大幅降低了时间和成本需求。通过对比泰国、韩国及在韩外籍人群的突变分布，研究证实--^SEA和-α^3.7缺失是东南亚地区的主要突变类型，而韩国本地人群的突变携带率极低。然而，随着全球人口流动增加，α-地中海贫血的筛查在低流行区（如韩国）也逐渐显现其重要性。本方法的推广将有助于实现α-地中海贫血的早期诊断和预防，特别是在资源有限地区。未来需进一步优化试剂盒以覆盖更多罕见突变类型，并推动其纳入临床指南。