冷冻热疗联合IL-6/IL-17A中和通过自分泌TNF-α诱导CD40表达促进髓源抑制细胞重编程及Th1主导抗肿瘤免疫

《Clinical and Translational Medicine》：Reprogrammed MDSCs promote Th1-dominant antitumour response via CD40 induced by autocrine TNF-α after combining cryo-thermal therapy with IL6 and IL17A neutralization

本研究揭示了冷冻热疗（CTT）联合IL-6和IL-17A中和抗体通过活性氧（ROS）-核因子κB（NF-κB）通路诱导髓源抑制细胞（MDSCs）自分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α），进而上调CD40表达。重编程的MDSCs通过CD40-CD40L相互作用促进CD4+ T辅助细胞1（Th1）极化，最终建立系统性抗肿瘤免疫。该策略为非小细胞肺癌（NSCLC）等恶性肿瘤提供了新的联合治疗思路。

　　

摘要

本研究旨在探讨冷冻热疗（Cryo-thermal Therapy, CTT）联合白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素17A（IL-17A）中和抗体（简称联合疗法）在Lewis肺癌1（LLC1）荷瘤小鼠模型中诱导髓源抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）重编程及T辅助细胞1（T Helper 1, Th1）主导分化的机制。

背景

免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），特别是MDSCs，限制了T细胞靶向免疫疗法的疗效。MDSCs重编程可增强免疫治疗效果，但其潜力常被持续的免疫抑制性细胞因子和细胞间相互作用所限制。前期研究发现，新型CTT可驱动MDSCs成熟并诱导CD4⁺ Th1主导分化，改善高转移性小鼠模型的长期生存。鉴于IL-6和IL-17A在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）进展和免疫逃逸中的作用，本研究在LLC1荷瘤小鼠中开发了将细胞因子中和与CTT相结合的联合策略。尽管联合疗法成功促进了MDSCs成熟和Th1分化，但其潜在机制尚不清楚。

方法

在LLC1荷瘤小鼠中实施联合疗法。观察其对MDSCs成熟和Th1分化的影响，并通过检测CD40表达、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）-核因子κB（Nuclear Factor-kappa B, NF-κB）通路及肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）的诱导等方面探索相关机制。

结果

研究发现，联合疗法通过ROS-NF-κB通路依赖的TNF-α诱导，增加了MDSCs上CD40的表达。这种TNF-α介导的CD40上调通过CD4⁺ T细胞上的CD40L（CD40 Ligand）结合促进了Th1极化。结果首次提供了机制性证据，表明联合疗法后重编程的MDSCs通过自分泌TNF-α调控CD40表达。

结论

本研究阐明了MDSCs重编程的方法和机制，为NSCLC及其他类型癌症患者提供了一种有前景的治疗策略。

1 引言

近年来，针对功能受损或耗竭T细胞的免疫疗法及工程化T细胞方法取得了临床进展。然而，这些策略的治疗潜力受到肿瘤微环境中免疫抑制性细胞成分，特别是MDSCs的极大限制。MDSCs积极抑制T细胞活化和细胞毒功能，从而促进多种恶性肿瘤的免疫逃逸。因此，对这种免疫抑制性TME进行 therapeutic 重编程是实现最佳抗肿瘤反应的关键需求。

细胞因子网络在TME中协调肿瘤进展和免疫细胞相互作用方面起着基础性作用。例如，转化生长因子-β（TGF-β）、IL-1和IL-17A促进肿瘤细胞增殖和转移；IL-6可破坏细胞因子调节并促进肿瘤进展；而IL-4、IL-10和TGF-β则引起免疫抑制。针对这些细胞因子的最新进展显示出调节免疫系统、抑制肿瘤进展和克服常规疗法耐药性的治疗潜力。然而，大多数细胞因子单克隆抗体的临床试验显示出有限或无益的效果。此外，单一的细胞因子疗法未能重塑免疫抑制环境，最终导致肿瘤进展，这意味着联合策略为克服常规免疫疗法耐药性和改善患者预后开辟了新途径。

在前期研究中，我们建立了一种新型物理疗法，通过交替液氮冷却和射频加热对实体瘤进行原位消融，称为冷冻热疗。CTT促进包括MDSCs在内的先天免疫细胞成熟，诱导CD4⁺ Th1主导分化，并最终系统性重塑免疫环境，有效提高了黑色素瘤和三阴性乳腺癌荷瘤小鼠的长期生存率。然而，在LLC1荷瘤小鼠中，单独使用CTT仅延长了生存时间，未能完全抑制自发性肿瘤转移，这表明我们需要探索控制高恶性度肿瘤的最佳联合疗法。

高水平IL-6和IL-17A可诱导免疫抑制，并且已经提出了几种阻断这两种细胞因子作为治疗靶点的策略。在最近的研究中，鉴于CTT后LLC1肿瘤模型中血清IL-6和IL-17A浓度显著升高，而这两种细胞素是促进NSCLC进展和MDSCs介导免疫逃逸的关键细胞因子，我们将CTT与IL-6和IL-17A中和相结合，提高了LLC1小鼠模型的生存率。从机制上讲，联合疗法不仅减少了MDSCs的积累，还促进了其成熟，激活了CD4⁺ Th1细胞介导的抗肿瘤免疫，并增强了有效的T细胞和自然杀伤细胞介导的肿瘤杀伤。免疫抑制性MDSCs阻止CD4⁺ T细胞向Th1亚型分化并促进调节性T细胞极化，导致肿瘤进展。因此，在前期研究中，联合疗法后MDSCs的成熟和Th1主导的CD4⁺ T细胞分化表明联合疗法导致了系统性免疫环境的重塑，这反过来有助于MDSCs和CD4⁺ T细胞的相互调节。联合疗法后MDSCs和CD4⁺ T细胞之间相互作用的潜在机制仍有待阐明。

本研究证明联合疗法在LLC1模型中驱动MDSCs成熟并促进Th1极化的CD4⁺ T细胞分化。通过整合RNA测序和体外验证，我们确定联合疗法重编程的MDSCs通过CD40–CD40L相互作用介导Th1偏向。关键的是，我们确定了一个自分泌循环，其中MDSCs来源的TNF-α上调CD40表达，进而通过NF-κB通路激活加强TNF-α的产生。这些发现揭示了一个先前未被认识的自我强化机制，即成熟MDSCs通过NF-κB信号自主调节CD40/TNF-α表达，最终建立以CD4⁺ Th1主导为特征的系统性抗肿瘤免疫。

2 材料与方法

2.1 细胞培养和小鼠肿瘤模型建立

Lewis肺癌LLC1细胞系由上海交通大学夏伟梁教授惠赠。结肠癌MC38细胞系由上海交通大学古宏晨教授惠赠。细胞培养于添加10%热灭活胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基中。

雌性C57BL/6小鼠饲养于12小时光暗循环环境的隔离笼中，饲喂标准小鼠营养配方无菌饲料和无菌水。将1×10⁶个LLC1细胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠右背部建立肿瘤模型。动物研究方案经上海交通大学生物医学工程学院和Med-X研究院伦理委员会批准。

2.2 治疗程序

冷冻热疗通过依次进行液氮冷冻和射频消融实施。

对于体内IL-6和IL-17A中和，小鼠在指定时间点腹腔注射抗IL-6单克隆抗体和抗IL-17A单克隆抗体。

对于体内清除ROS，接受联合疗法治疗的小鼠同时腹腔注射还原型谷胱甘肽。

2.3 MDSCs和CD4⁺ T细胞的分离

在不同时间点收集肺组织，获取单细胞悬液。使用单克隆抗体标记GR-1阳性细胞，并通过正选试剂盒分离MDSCs。使用CD4阳性选择试剂盒分离CD4⁺ T细胞。

2.4 RNA测序与分析

从分离的MDSCs和CD4⁺ T细胞中提取总RNA。评估RNA纯度和质量后，构建RNA-seq文库并进行转录组测序。使用GSEA软件进行富集分析。

2.5 体外免疫细胞培养实验

为研究MDSCs对CD4⁺ T细胞分化的作用和机制，将CTT后第14天的CD4⁺ T细胞与CTT或联合疗法后的MDSCs直接共培养，在有或无CD40L阻断和TNF-α单克隆抗体的情况下进行。添加相应组别的小鼠血清以模拟体内环境。

2.6 流式细胞术

制备单细胞悬液，使用Zombie染料排除死细胞，进行表面标志物和转录因子染色。对于细胞内细胞因子染色，细胞在刺激剂存在下培养。数据使用流式细胞仪采集并通过FlowJo处理。

2.7 mRNA分离和实时荧光定量PCR

使用TRIzol和反转录试剂盒进行RNA提取和反转录。使用实时荧光定量PCR系统检测基因表达，结果通过ΔΔCt法以GAPDH为内参进行标准化。

2.8 ELISA

收集不同组别的共培养上清液，使用ELISA试剂盒检测TNF-α浓度。

2.9 蛋白质印迹法

使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞获取蛋白 lysates。使用特定抗体检测磷酸化NF-κB p65、总NF-κB p65和actin等蛋白表达。

2.10 统计分析

所有数据以均值±标准差表示。两组比较使用双侧Student's T检验，多组比较使用单因素方差分析。使用Kaplan-Meier法和log-rank检验比较小鼠生存率。

3 结果

3.1 联合疗法提高了小鼠的长期生存率

对癌症基因组图谱患者数据的基因组分析发现，NSCLC中IL6基因扩增发生率最高，IL17A扩增也较为显著。在LLC1小鼠模型中，单独IL-6/IL-17A中和或CTT延长了生存时间但未提高生存率，而联合疗法实现了50%的长期生存率。CTT联合抗PD-1治疗效果优于抗PD-1单药，但仍显著低于联合疗法。

3.2 联合疗法促进MDSCs成熟并诱导Th1主导的CD4⁺ T细胞分化

鉴于LLC1皮下肿瘤模型会自发形成肺转移结节，且CTT可完全清除原发侧腹肿瘤，研究重点考察了肺转移灶的免疫变化。RNA测序显示，联合疗法处理后MDSCs的转录变化比CTT组更显著。GSEA分析显示，联合疗法后MDSCs中与成熟、活化以及TNF家族受体配体结合相关的信号通路上调。细胞因子相关基因中，Tnf表达上调最显著。共刺激分子相关基因分析显示，联合疗法后MDSCs上多个TNF超家族成员表达激活，其中Cd40变化模式尤为突出。同时，MDSCs中对其生存和免疫抑制功能至关重要的代谢通路显著下调。CD4⁺ T细胞的基因表达特征也发生显著改变，其活化、抗原呈递和干扰素相关信号等抗肿瘤特征被激活，TNF受体结合也显着富集。

流式细胞术分析证实，联合疗法进一步抑制了肺MDSCs的积累，并显著提高了MHCII⁺成熟MDSCs的比例和CD40的表达水平。联合疗法还显著增加了肺CD4⁺ T细胞的比例和增殖，并诱导了效应记忆表型和Th1亚群的主导分化。

3.3 IL-6和IL-17A中和直接促进冷冻热疗后肺MDSCs上CD40和TNF-α的表达水平

为探究哪种细胞直接受细胞因子中和影响，分离CTT后第5天的肺MDSCs或CD4⁺ T细胞进行体外培养。结果显示，体外添加中和抗体直接作用于MDSCs，显著提高了其CD40和TNF-α的表达水平及培养上清中TNF-α浓度，但未改变CD86和MHCII水平。qRT-PCR显示，体外细胞因子中和显著上调了MDSCs中IL-12、CD40和Tnf等刺激分子表达，下调了IL-10、iNOS、Arg-1和PD-L1表达。然而，体外细胞因子中和并未直接诱导CD4⁺ T细胞向Th1亚型分化。

3.4 联合疗法后分离的肺MDSCs通过TNF-α–CD40/CD40L轴促进Th1主导的CD4⁺ T细胞分化

共培养实验表明，与CTT后MDSCs共培养相比，与联合疗法后MDSCs共培养的CD4⁺ T细胞表现出Th1分化和效应功能增强。这种促进作用可被CD40L阻断或TNF-α中和所取消。联合疗法后MDSCs共培养还降低了Th2和T滤泡辅助细胞比例，对Th17和调节性T细胞无影响。单独添加或中和TNF-α对CD4⁺ T细胞分化无直接影响。机制上，CD40/CD40L相互作用阻断不影响MDSCs的TNF-α表达，但TNF-α中和显著降低了联合疗法后MDSCs上CD40的表达水平。在CTT后MDSCs培养体系中添加重组TNF-α可诱导CD4⁺ T细胞Th1分化，此效应可被CD40L阻断所逆转。

3.5 联合疗法后成熟的肺MDSCs通过NF-κB信号通路介导的自分泌TNF-α诱导CD40表达进而促进Th1分化

GSEA分析显示，联合疗法后MDSCs中NF-κB信号通路的正调控显著富集。蛋白质印迹证实联合疗法后MDSCs中p-p50/p50和p-p65/p65比值显著升高，A20水平降低，表明NF-κB通路激活。体外添加NF-κB抑制剂JSH-23可显著降低联合疗法后MDSCs的TNF-α表达和分泌。JSH-23处理也降低了联合疗法后MDSCs上CD40的表达。在CTT后MDSCs培养中添加重组TNF-α可上调CD40表达，此效应可被NF-κB抑制所逆转。共培养实验中，NF-κB通路抑制逆转了联合疗法后MDSCs对CD4⁺ T细胞Th1极化的诱导作用。

研究还发现，CTT显著增强了MDSCs中的ROS生物合成和NF-κB通路活性，联合疗法进一步增强了ROS诱导。体内清除ROS后，MDSCs上CD40和TNF-α的表达以及CD4⁺ T细胞中Th1比例均显著降低。

3.6 联合疗法促进MC38双侧肿瘤模型远端肿瘤中MDSCs成熟和Th1主导的CD4⁺ T细胞分化

在MC38双侧荷瘤模型中，仅对一侧肿瘤进行CTT，联合疗法显著抑制了对侧未处理肿瘤的生长，效果优于单独CTT或冷冻消融联合细胞因子中和。流式分析显示，联合疗法后未处理侧肿瘤MDSCs上CD40和TNF-α表达显著升高，CD4⁺ T细胞中Th1亚群比例也显著增加。体外实验证实，NF-κB通路抑制降低了联合疗法后MDSCs的TNF-α和CD40表达，并逆转了其对CD4⁺ T细胞Th1分化的诱导作用。这表明在MC38模型中，联合疗法同样通过激活MDSCs中NF-κB信号通路上调TNF-α和CD40表达，诱导Th1主导的CD4⁺ T细胞分化，从而抑制远端肿瘤生长。

4 讨论

本研究阐明了CTT联合IL-6和IL-17A中和疗法通过激活MDSCs中ROS-NF-κB信号通路，诱导其自分泌TNF-α，进而上调CD40表达的机制。高表达CD40的成熟MDSCs通过CD40-CD40L相互作用有效促进CD4⁺ T细胞向Th1分化，建立长期抗肿瘤免疫。该研究揭示了重编程MDSCs自分泌TNF-α调控CD40表达的新机制，为NSCLC等恶性肿瘤的联合免疫治疗提供了新策略。CTT已获批用于临床原发性及转移性肝癌和肺癌的治疗，而IL-6和IL-17A单克隆抗体药物也已用于其他疾病治疗，因此该联合策略具有较高的临床转化前景。未来临床应用中需注意监测血清细胞因子水平及药物相关不良反应。