靶向BET抑制调控CLEC4E重塑免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞以增强抗肿瘤免疫

《Clinical and Translational Medicine》：Targeting CLEC4E in immunosuppressive tumour-associated macrophages via BET inhibition

本研究揭示了CLEC4E在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中的免疫抑制功能，通过BET抑制剂（如NHWD-870）靶向BRD4/CEBPβ/CLEC4E轴，可有效抑制TAM增殖并增强T细胞毒性，为癌症免疫治疗提供了新策略。

　　

3 RESULTS

3.1 Enrichment of CLEC4E in TAMs is associated with unfavourable patient survival

研究首先通过RNA测序发现，与M0巨噬细胞相比，CLEC4E在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中显著上调且高表达。在黑色素瘤患者的配对肿瘤和癌旁组织评估中，CLEC4E与巨噬细胞标志物CD68在肿瘤中存在强烈共定位，而癌旁组织中CLEC4E表达减少且巨噬细胞频率较低。TCGA数据库分析进一步显示，皮肤癌中CLEC4E表达显著高于正常组织，且与巨噬细胞标志物（CD14和CD68）呈正相关，而与肿瘤细胞标志物（S100B和MIA）无关，表明CLEC4E特异性富集于肿瘤微环境中的巨噬细胞。

临床相关性分析显示，III/IV期黑色素瘤患者的CLEC4E表达显著高于I/II期患者。生存分析表明，高CLEC4E表达与不良预后相关。同样，CLEC4E⁺ TAM浸润较多的患者临床结局较差。同时具有高CD68⁺ TAM和高CLEC4E表达的患者预后最差。

3.2 Macrophage-expressing CLEC4E promotes tumour progression

为探究CLEC4E在TAM中的作用，研究通过将Clec4e^flox/flox小鼠与Lyz2-cre小鼠杂交，构建了髓系特异性CLEC4E敲除小鼠（Lyz2 ΔCLEC4E）。在皮下黑色素瘤模型中，Lyz2 ΔCLEC4E小鼠肿瘤生长显著抑制，且生存期改善。在卵巢癌腹膜植入模型中，Lyz2 ΔCLEC4E小鼠腹水形成减少，生存期延长，肿瘤结节更少且更小。流式细胞术分析显示，CLEC4E敲除降低了CD206⁺ TAM频率，表明M2样促肿瘤巨噬细胞极化减少。

3.3 CLEC4E deletion reprograms TAM towards an anti-tumour phenotype

通过scRNA-seq分析黑色素瘤组织，主要细胞群包括B16肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞和T细胞。髓系簇中，巨噬细胞占绝大多数，树突状细胞构成其余部分。巨噬细胞进一步分为三个亚群（TAM1、TAM2、TAM3），但Lyz2 ΔCLEC4E与对照组在这些亚群比例上无差异。

伪时间分析将TAM发育轨迹分为五个状态。Lyz2 ΔCLEC4E和对照组细胞沿此轨迹分布不同：状态2和5细胞减少，状态1和4细胞扩增。状态1以表达趋化因子和抗体依赖性受体为特征，提示促炎表型；状态2与细胞增殖相关；状态4高表达抗原呈递相关基因，表明抗肿瘤功能；状态5表达血红蛋白相关基因及细胞增殖标志物。CLEC4E缺失抑制了增殖TAM比例，扩大了具有抗原呈递能力和抗肿瘤反应的巨噬细胞群体。

通路富集分析显示，细胞因子相关反应、抗原加工呈递和防御反应在状态1和4中富集。RT-PCR验证了CLEC4E敲除巨噬细胞中趋化因子（CXCL9和CCL8）、抗原受体（FCGR4和FCGRT）、促炎细胞因子（IL1B）和抗原呈递分子（CD74、H2AA和H2AB1）表达上调。

3.4 TAM proliferation is inhibited in the absence of CLEC4E through ERK/MAPK pathway

免疫荧光分析显示，Lyz2 ΔCLEC4E组Ki67⁺巨噬细胞比例降低，每视野巨噬细胞计数减少。从肿瘤中分选F4/80⁺CD11b⁺巨噬细胞的RT-PCR显示，增殖标志物（MKI67、CCNA2、CCND1、MCM2和CDK1）在Lyz2 ΔCLEC4E组受到抑制。

体外沉默CLEC4E的BMDM测序显示，KEGG通路中细胞周期通路最显著富集。RT-PCR进一步验证了细胞周期相关基因（MKI67、CCNA2、CCNB2、CCND1、CDK1、MCM2和MCM5）的下调。

蛋白质组和磷酸化蛋白质组测序显示，Mapk3（Erk1）磷酸化在CLEC4E敲除巨噬细胞中显著降低。蛋白互作分析表明，Mapk3（Erk1）是磷酸化显著抑制的关键蛋白。CLEC4E配体TDB刺激巨噬细胞后，Erk、PLC-γ2和Syk磷酸化水平增强，表明Erk通路是CLEC4E的下游信号靶点。CCK-8实验显示，TDB诱导的增殖被Erk抑制剂有效抑制。从Lyz2 ΔCLEC4E和对照组小鼠分离的巨噬细胞，在M0和TAM极化条件下，CLEC4E敲除巨噬细胞增殖显著减少。

3.5 CLEC4E knockout strengthens macrophage??T cell interaction and promotes T-cell cytotoxicity

细胞互作分析显示，Lyz2 ΔCLEC4E肿瘤中细胞互作增强，推断互作数量及总体强度显著增加。巨噬细胞与T细胞互作在CLEC4E敲除后增加五倍。配体-受体对分析显示，巨噬细胞与T细胞间互作增强，包括H2-K1/H2-D1（MHCI）-CD8和CD86-CD28对，它们分别是T细胞激活过程中信号1和2的关键。此外，T细胞吸引趋化因子表达在敲除组上调。RT-PCR验证了CLEC4E敲除小鼠中MHCI和CD86表达增加。

T细胞群分析显示，活化增殖标志物（Gzmb、IFN-γ、Tnfrsf4、Mki67和Top2a）表达增加，表明T细胞活化功能增强。流式细胞术显示，颗粒酶B表达CD8⁺ T细胞比例升高，免疫组化染色结果一致。流式分析显示CD8⁺ T细胞浸润增加。患者样本中，CLEC4E表达与CD8⁺ T细胞丰度呈负相关。综上，巨噬细胞CLEC4E敲除增强了巨噬细胞-T细胞互作，促进了CD8⁺ T细胞毒性。

3.6 BET inhibitor is a strong candidate for CLEC4E inhibition

通过FDA批准药物库筛选，针对免疫学/感染通路和表观遗传剂的132种药物处理B16条件培养基诱导的RAW264.7巨噬细胞，BET抑制剂JQ1和NHWD-870显著降低CLEC4E水平。BMDM中，B16-CM刺激上调CLEC4E，低剂量BET抑制剂处理显著抑制。蛋白水平结果一致。

人单核细胞THP-1用黑色素瘤和卵巢癌细胞条件培养基诱导TAM，CLEC4E在TAM中富集并被BET抑制剂抑制。动物模型中，Yumm1.7黑色素瘤皮下模型给予NHWD-870或 vehicle，免疫染色显示CLEC4E与CD68强烈共定位，但BET抑制剂处理组CLEC4E荧光强度显著降低。

3.7 CLEC4E is suppressed by BET inhibitor via BRD4/CEBPB regulation

为阐明BET抑制剂下调CLEC4E机制，首先在BMDM中沉默BRD2、BRD3和BRD4。BRD4敲低显著降低CLEC4E表达，而BRD2或BRD3敲低无影响。ChIP-seq显示BRD4蛋白未直接结合CLEC4E基因组位点。

文献回顾发现CLEC4E表达受转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（CEBPβ）调控。沉默CEBPβ下调CLEC4E。BET抑制剂和BRD4对CEBPβ调控显示，BRD4敲低（而非BRD2或BRD3）导致CEBPβ显著减少。人巨噬细胞中BRD4敲低也降低CEBPβ。BET抑制剂处理不同肿瘤条件培养基诱导的TAM，显著抑制CEBPβ表达。

双荧光素酶报告基因检测显示，BRD4过表达显著增强CEBPβ启动子活性。ChIP-seq观察到BRD4结合CEBPβ启动子区，且该结合在BET抑制剂处理或BRD4沉默后减弱，表明直接转录调控。综上，BET抑制剂通过靶向BRD4抑制CLEC4E表达，BRD4直接调控CEBPβ——CLEC4E的上游调节因子。

4 DISCUSSION

本研究揭示了巨噬细胞表达CLEC4E在黑色素瘤和卵巢癌中的促肿瘤作用，拓宽了其在肿瘤中的功能认知。通过髓系特异性条件敲除小鼠模型，排除了CLEC4E对其他细胞类型的影响。scRNA-seq全面解析了CLEC4E介导TAM免疫抑制功能的机制，首次阐明CLEC4E促进TAM增殖。蛋白质组测序进一步确定Mapk/Erk通路是CLEC4E的下游分子。

研究明确了CLEC4E对肿瘤免疫微环境的影响，缺失增强了巨噬细胞-T细胞互作。既往研究讨论了CLEC4E与CD4⁺ T细胞的关联，但本肿瘤模型中CLEC4E对CD8⁺ T细胞作用更显著，不仅配体-受体变化强调MHCI-CD8相关性增强，CD8⁺ T细胞频率及其颗粒酶B表达也随CLEC4E缺失增加。

BET抑制剂NHWD-870通过靶向转录因子C/EBPβ强烈抑制CLEC4E。BET抑制剂是新型抗癌剂，其分子机制仍在探索中。BRD4的直接靶基因主要是转录因子，包括MYC、BCL2和IL7R。本研究首次报道BRD4直接结合巨噬细胞中CEBPβ启动子。C/EBPβ通常与内质网应激（ER stress）和炎症相关，也促进癌症进展。通过抑制CEBPβ表达，BET抑制剂调控CLEC4E，可能也介导其他免疫调节基因，需进一步研究以揭示BET抑制剂的更多机制。

5 CONCLUSION

总之，TAM上CLEC4E表达通过促进TAM增殖和损害T细胞功能，促免疫抑制肿瘤微环境并驱动肿瘤进展。BET抑制剂通过靶向BRD4/CEBPβ轴有效抑制TAM中CLEC4E表达，从而恢复巨噬细胞抗肿瘤活性并增强T细胞介导的细胞毒性，最终抑制肿瘤生长。