血清54种细胞因子与趋化因子谱揭示强直性脊柱炎独特炎症特征及诊断生物标志物

《Immunity, Inflammation and Disease》：Serum Levels of 54 Cytokines and Chemokines Reveal Distinct Inflammatory Signatures in Ankylosing Spondylitis

本研究通过检测31例强直性脊柱炎（AS）患者和20例健康对照（HC）血清中54种细胞因子/趋化因子，发现AS患者存在12种细胞因子（包括TNF-α、IL-17A、IP-10/CXCL10等）显著升高和9种细胞因子（包括IL-4、VEGF-D等）显著降低的独特炎症特征。主成分分析（PCA）和ROC曲线显示IP-10/CXCL10（AUC=1.00）和VEGF-D（AUC=0.98）具有卓越诊断价值，为AS的病理机制研究和临床诊断提供了新视角。

　　

ABSTRACT

背景

强直性脊柱炎（AS）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，主要累及中轴骨骼。了解AS中的细胞因子和趋化因子特征对于阐明疾病机制和识别潜在诊断生物标志物至关重要。

方法

分析了31例AS患者和20例年龄匹配的健康对照（HC）的血清样本。使用Meso Scale Discovery（MSD）电化学发光免疫分析法测量了54种细胞因子、趋化因子和血管生成相关因子的浓度。数据分析包括血清细胞因子水平的统计比较、热图聚类、主成分分析（PCA）和受试者工作特征（ROC）曲线分析。通过定量实时PCR使用SKG小鼠（AS的自发动物模型）的外周血单核细胞（PBMC）进行验证。

结果

与HC相比，AS患者的12种细胞因子（TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-17D、VEGFA、ICAM1、SAA、IP-10/CXCL10、MIP-3α/CCL20、sFlt-1/VEGFR-1、CRP和MCP-4/CCL13）血清浓度显著更高，而9种细胞因子（IL-4、IL-8、IL-17C、MIP-1α/CCL3、eotaxin-3/CCL26、PlGF、VEGF-C、VEGF-D和bFGF）的浓度显著更低（所有p < 0.05）。热图聚类和PCA显示AS患者和HC之间存在明显分离。ROC曲线分析显示IP-10/CXCL10（AUC = 1.00）、VEGF-D（AUC = 0.98）、IL-17A（AUC = 0.87）、TNF-α（AUC = 0.85）和ICAM1（AUC = 0.84）具有极好的诊断准确性。观察到IL-17A和MIP-3α/CCL20之间，以及VEGFA和sFlt-1之间存在正相关，表明协调的炎症和血管生成通路。在SKG小鼠中的验证实验证实了IP-10/CXCL10表达升高和VEGF-D表达降低，支持了跨物种相关性。

结论

本研究在AS患者中识别出独特的细胞因子和趋化因子谱。IP-10/CXCL10和VEGF-D成为具有高区分能力的有前景的诊断生物标志物。同时也强调了几种先前未报道的免疫介质。这些发现为AS的发病机制提供了新的见解，并提示了未来治疗干预的潜在靶点。

1 引言

强直性脊柱炎（AS）是一种主要累及中轴骨骼的慢性炎症性风湿病，其特征是炎性背痛、骶髂关节炎、进行性脊柱强直和附着点炎。流行病学研究报告AS的全球患病率约为0.1%–1.4%，存在显著的区域和种族差异。该疾病通常在三十多岁的人群中出现，最高发病率在30至39岁之间，导致显著的经济和医疗负担。

尽管AS的具体致病机制尚不清楚，但许多研究人员报告称，该疾病是由于遗传和环境因素之间复杂的相互作用而发生的，这些因素进而激活免疫介导的炎症通路，驱动其发作和进展。在遗传因素中，HLA-B27是已知最强的AS风险因素，超过90%的AS患者携带该等位基因。然而，HLA-B27影响AS发病机制的确切机制仍未完全明了。涉及异常细胞因子和趋化因子反应的免疫失调在驱动AS的慢性炎症、关节损伤和疾病进展中起关键作用。

细胞因子和趋化因子通过介导白细胞的招募、活化和分化以及维持炎症，对调节免疫反应产生重要影响。炎症因子的异常表达发生在不同的自身免疫和风湿性疾病中，包括类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）和银屑病关节炎（PsA）。类似地，AS患者的细胞因子谱也发生了改变，尽管对这些模式的全面表征和理解仍然有限。先前的研究主要集中于众所周知的炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-17（IL-17）和IL-23，它们在AS的发病机制中起重要作用，并且是生物制剂的治疗靶点。然而，许多其他细胞因子、趋化因子和血管生成因子在AS中的参与程度仍未得到充分评估。鉴于细胞因子和趋化因子失调与炎症性疾病之间已建立的联系，进一步评估这些免疫介质可能有助于阐明AS的潜在发病机制。

在本研究中，我们初步分析和比较了AS患者和健康对照（HC）血清中细胞因子、趋化因子和血管生成介质的谱图。我们专注于炎症细胞因子和趋化因子，包括TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-17D、IL-4、IL-8、IP-10/CXCL10、MIP-3α/CCL20、MCP-4/CCL13、VEGF家族成员、ICAM-1和其他关键的炎症介质，因为它们已确立或潜在参与AS的免疫发病机制。此外，还进行了生物信息学分析，以阐明这些差异表达细胞因子之间潜在的功能关系，从而揭示AS的新诊断生物标志物和治疗靶点。然而，这些细胞因子在区分AS和其他炎症性疾病方面的临床特异性尚未得到评估。需要进一步的研究来比较多种炎症性疾病的细胞因子特征，并评估联合细胞因子 panel 与当前AS诊断金标准相比的效果，以验证其临床适用性。

2 材料与方法

2.1 人类样本

本研究经四川省人民医院机构审查委员会批准。在2018年4月至2022年7月期间，共招募了31名AS患者和20名HC。所有参与者均遵循《赫尔辛基宣言》提供了知情同意。所有AS患者在采血前1周或更长时间内未接受全身免疫抑制治疗、皮质类固醇或生物制剂。有恶性肿瘤或自身免疫性疾病史的参与者被排除。HC的选择基于没有AS和已知的自身免疫性疾病。收集了人口统计学和临床数据，包括年龄、性别、HLA-B27状态、病程、生物治疗、Bath强直性脊柱炎疾病活动指数（BASDAI）评分和血细胞计数（中性粒细胞、白细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞）。

2.2 动物研究

6-8周龄的雌性SKG小鼠和年龄匹配的野生型BALB/c小鼠（WT对照）购自上海南方模式生物科技股份有限公司（中国），在特定病原体（SPF）条件下饲养，控制12小时光/暗循环和恒定温度。小鼠在SPF条件下维持，控制温度（22 ± 2°C）和湿度（50%–60%）。BALB/c小鼠作为SKG小鼠的对照组，每组包含六只小鼠（每组n = 6）。本研究中的所有实验方案均经四川省人民医院动物护理与使用委员会批准（批准号：A22-15）。

2.3 采样和细胞因子/趋化因子的测定

使用乙二胺四乙酸（EDTA）管从每位AS患者和HC采集静脉血样本。样本在环境温度下静置2小时，然后以3000 rpm离心10分钟。小心分离后，血清样本被保存以备后续分析。所有血清样本在分析前仅解冻一次，以确保稳定性，并储存于-80°C。

使用Meso Scale Discovery（MSD）电化学发光平台和V-PLEX Human Cytokine 30-Plex Kit按照特定方案测量血清细胞因子和趋化因子水平。简要来说，用缓冲液稀释后，将血浆样品加入测定板的重复孔底部。与检测抗体孵育并经过多次洗涤步骤后，加入读取缓冲液，使用MSD QuickPlex SQ120仪器分析板子。记录发射光强度以提供分析物的定量评估。每个细胞因子/趋化因子测定重复进行，并使用平均值进行分析。总共同时评估了54种免疫介质，从而可以进行全面的炎症谱分析。

分析的促炎细胞因子和免疫调节剂包括IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、TNF-α、GM-CSF、IL-1α、IL-5、IL-7、IL-12/IL-23p40、IL-15、IL-16、IL-17A、TNF-β、VEGF-A、IL-17A/F、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-1RA、IL-3、IL-9和TSLP。还量化了Th17相关细胞因子IL-17A (Gen. B)、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27和IL-31。趋化因子包括MIP-3α/CCL20、Eotaxin/CCL11、MIP-1β/CCL4、Eotaxin-3/CCL26、TARC/CCL17、IP-10/CXCL10、MIP-1α/CCL3、MCP-1/CCL2、MDC/CCL22和MCP-4/CCL13。评估了血管生成相关介质VEGF-A、VEGF、VEGF-C、VEGF-D、Tie-2、sFlt-1/VEGFR-1、PlGF和bFGF。血管损伤标志物包括SAA、CRP、VCAM-1和ICAM-1。样品重复检测，结果以两次测量的平均值表示。每个分析物的变异系数和灵敏度均在制造商的预期范围内。每种分析物的检测限符合制造商的规格。

2.4 SKG小鼠PMBC样本的单细胞悬液制备

从SKG小鼠采集的新鲜静脉血收集在EDTA包被的抗凝管中。随后用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）按1:1的比例稀释血液。将等体积的稀释血液和Ficoll淋巴细胞分离液轻轻铺在50 mL离心管中。然后使用水平转子，在2000 rpm和20°C下离心20分钟，刹车设置为零以保持细胞分层。小心收集外周血单核细胞（PBMC）层后，将其加入15 mL管中。用10 mL PBS洗涤细胞，然后离心（300 × g，10分钟）。弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL PBS中，并在相同条件下再次离心。经过两次洗涤步骤后，将剩余的细胞沉淀轻轻重悬于补充有0.04% BSA的RPMI-1640培养基（1 mL）中。使用Luna细胞计数器对所得单细胞悬液进行定量，并通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。

2.5 qPCR

使用Rotor-Gene Q系统（美国马里兰州德国镇Qiagen公司）进行定量实时聚合酶链反应（qPCR）。每个20 μL反应混合物包含10 μL SYBR Green Master Mix（北京TransGen Biotech公司）、1 μL cDNA模板（100 ng）和基因特异性引物。所有样品进行45个循环的扩增。通过2^?ΔΔCt方法量化基因表达水平。实验遵循MIQE指南进行。看家基因18S rRNA作为内参进行标准化。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列和相应的目录号如下：IP-10/CXCL10（正向：CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC；反向：GGCTCGCAGGGATGATTTCAA）和VEGF-D（正向：TTGAGCGATCATCCCGGTC；反向：GCGTGAGTCCATACTGGCAAG）。

2.6 统计分析

采用IBM SPSS Statistics 20（美国纽约州阿蒙克市IBM公司）和GraphPad Prism 8（美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad Software公司）进行数据分析。在统计检验前剔除异常值。检验数据分布的正态性，并相应地应用参数（t检验）或非参数（Mann-Whitney U检验）检验。通过进行Mann-Whitney U检验和未配对t检验来比较AS患者和HC之间的细胞因子和趋化因子浓度。使用Bonferroni校正对通过Mann-Whitney U检验进行的多重比较进行调整。随后，将数据矩阵导入R包软件中进行多变量统计分析，包括主成分分析（PCA）（R包“prcomp”）、热图（R包“pheatmap”）和受试者工作特征（ROC）曲线（R包“pROC”）。采用Spearman相关检验评估细胞因子水平与临床参数的相关性。AUC值根据既定标准进行解释。人口统计学和临床变量，包括年龄、性别、HLA-B27状态、生物治疗、病程和血细胞计数，以均值 ± 标准差（SD）表示。所有结果在p < 0.05时被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 参与者的基线特征

本研究共涉及31名AS患者和20名HC。所有参与者均满足 eligibility criteria。两组的人口统计学和临床数据如表1所示。AS患者和HC的年龄和性别分布具有可比性。AS组和HC组中男性分别占74%和75%，这两组的平均年龄分别为35.17 ± 10.76岁和33.15 ± 8.96岁。AS组的平均病程为6.22年。所有AS患者（100%）HLA-B27检测呈阳性。在AS患者中，16人（51.6%）曾接受过生物治疗。AS组的平均BASDAI评分为3.82 ± 1.17。与HC相比，AS组的白细胞、中性粒细胞和单核细胞计数显著更高（p < 0.05），而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数在两组之间无显著差异（p > 0.05）。

3.2 血清细胞因子和趋化因子水平

为了研究AS中的全身性炎症改变，测量了AS组和HC组中54种免疫介质的血清水平。其中，50种细胞因子和趋化因子在两组超过75%的血清样本中被检测到，并被纳入进一步分析。其余四种分子（IL-1β、IL-23、IL-31和IL-1α）的检出率低于50%，因此被排除在进一步的统计比较之外。将这些细胞因子的数据导入R软件进行PCA。主成分1和2分别占该数据集总方差的19.9%和18.4%。

总共有21种细胞因子在AS组和HC组之间存在显著差异。绘制了21种细胞因子的无监督聚类热图，以了解AS组和HC之间差异细胞因子的表达情况。这些生物标志物可以区分大多数AS患者和HC。AS和HC组形成两个明显、重叠最少的簇，而对21种差异细胞因子的层次聚类将大多数AS患者与HC分开，突出了它们的区分潜力。12种细胞因子的水平在AS患者中明显更高，包括TNF-α、TNF-β、IL-17A、VEGFA、ICAM1、SAA、IL-17D、IP-10/CXCL10、MIP-3α/CCL20、sFlt-1/VEGFR-1、CRP和MCP-4/CCL13（p < 0.05）。其中，CRP显示出最高的倍数变化（FC），在AS患者中比HC高约40.72倍（p < 0.0001）。此外，SAA（FC = 36.67；p < 0.0001）、TNF-β（FC = 5.58；p = 0.025）和IP-10/CXCL10（FC = 5.55；p < 0.0001）显著更高。该升高组中的其他细胞因子呈现中等FC，介于1.32倍至4.36倍之间。CRP和SAA显示出最大的动态范围增加，而IP-10/CXCL10、Flt-1和ICAM-1在AS中也显示出显著升高，反映了强烈的全身炎症激活和内皮参与。

相反，AS组中IL-4、IL-8、IL-17C、MIP-1α/CCL3、eotaxin-3/CCL26、PlGF、VEGF-C、bFGF和VEGF-D的血清浓度明显低于HC组（p < 0.05）。MIP-1α显示出0.39倍的降低（p < 0.0001），而IL-8显示出0.45倍的降低（p < 0.0001）。其余细胞因子在两组的FC为0.62–0.84。VEGF-D和VEGF-C在AS患者中显示出最明显的减少，伴随着IL-8、IL-4和MIP-1α水平持续较低，表明AS中血管生成信号受损和趋化反应减弱。

应用Bonferroni校正进行多重比较后，八种细胞因子（IL-8、TNF-α、VEGF-D、PlGF、IP-10、MIP-1α、ICAM1和CRP）在AS组和HC组之间显示出显著差异（p < 0.05）。然而，其余37种分析物无显著差异（p > 0.05）。

3.3 ROC曲线分析

为了分析这些细胞因子和趋化因子是否可用于区分AS患者和HC，进行了ROC曲线分析，使用曲线下面积（AUC）作为评估标准。根据既定标准，AUC为0.50–0.59表示无诊断价值，0.60–0.69表示区分能力有限或较差，0.70–0.79表示可接受的诊断准确性，0.80–0.89表示出色的区分能力，≥ 0.90表示卓越的区分性能。基于这些标准，我们的结果可以分为不同的组。首先，TNF-β（AUC = 0.562）显示出无意义的区分能力。几种细胞因子，包括bFGF（AUC = 0.685）、VEGFA（AUC = 0.669）、VEGF-C（AUC = 0.681）、eotaxin-3（AUC = 0.677）和IL-17A（AUC = 0.699），表现出较差的区分能力。诸如SAA（AUC = 0.713）、MCP-4（AUC = 0.742）、IL-17C（AUC = 0.765）、IL-17D（AUC = 0.765）、PlGF（AUC = 0.769）、IL-4（AUC = 0.781）和MIP-3α（AUC = 0.789）等细胞因子显示出可接受的诊断性能。诸如TNF-α（AUC = 0.811）、ICAM1（AUC = 0.808）、IL-8（AUC = 0.881）和CRP（AUC = 0.856）等细胞因子显示出出色的区分准确性。IP-10/CXCL10（AUC = 1.000）、VEGF-D（AUC = 0.976）、MIP-1α（AUC = 0.900）和sFlt-1/VEGFR-1（AUC = 0.901）表现出卓越的诊断能力（所有p < 0.001），表明它们作为AS诊断或疾病监测生物标志物的强大潜力。四种细胞因子达到卓越性能（AUC ≥ 0.90），四种显示出出色的区分能力，其他几种达到可接受水平，提供了跨 panel 诊断价值的分层概述。

3.4 通过qPCR验证SKG小鼠中IP-10/CXCL10和VEGF-D的表达

为了验证临床发现，我们通过进行qPCR检查了从SKG小鼠分离的PBMC中IP-10/CXCL10和VEGF-D的mRNA表达水平。SKG小鼠经常被用作动物模型，因为它们自发出现脊柱关节炎样特征，这使得它们适合于研究AS相关的免疫机制。如图所示，与野生型对应物相比，IP-10/CXCL10在SKG小鼠中显著上调，而VEGF-D显著下调（p < 0.01）。这些结果与在AS患者血清中发现的蛋白质水平改变一致；因此，我们的发现支持这些细胞因子跨物种的转化相关性。IP-10/CXCL10增加和VEGF-D减少的相反趋势与在人血清中观察到的改变平行，强化了它们在跨物种间的一致性。这些结果强化了IP-10/CXCL10和VEGF-D作为与AS相关免疫失调相关的稳健生物标志物的潜力。

3.5 Spearman等级相关分析

采用相关分析来检查在AS患者中显著改变的细胞因子和趋化因子之间的相互作用。在AS患者中升高的细胞因子中，IP-10/CXCL10与TNF-β显示出显著相关（p = 0.000007），而ICAM1与sFlt-1/VEGFR-1显著相关（p < 0.0001）。此外，TNF-α与几种炎症介质显著相关，包括CRP（p = 0.0038）、MIP-3α/CCL20（p = 0.000611）、MCP-4（p = 0.0083）和IP-10/CXCL10（p = 0.0019），表明炎症通路是协调的。在血清水平降低的细胞因子中，IL-4与VEGF-C（p = 0.000041）、IL-17C（p = 0.00032）和MIP-1α/CCL3（p = 0.00032）显著相关，表明抗炎和血管生成相关细胞因子之间的相互作用可能发生在AS发病机制中。这些关联突出了免疫激活、趋化因子驱动的炎症和血管生成失调的复杂网络，这些网络导致了AS的潜在机制。

4 讨论

AS是一种自身免疫性炎症性疾病，主要累及脊柱和骶髂关节，其典型特征是慢性炎症、结构损伤和进行性残疾。本研究全面调查了AS患者与HC相比的54种细胞因子和趋化因子的血清谱图。我们的结果显示几种细胞因子和趋化因子的血清水平显著更高，包括TNF-α、TNF-β、IL-17A、IL-17D、VEGFA、ICAM1、IP-10/CXCL10、MIP-3α/CCL20、sFlt-1/VEGFR-1、CRP、MCP-4/CCL13和SAA，而IL-4、IL-8、IL-17C、MIP-1α/CCL3、eotaxin-3/CCL26、PlGF、VEGF-C、VEGF-D和bFGF的血清水平显著更低。此外，通过使用SKG小鼠的PBMC进行RT-PCR，我们发现IP-10/CXCL10在转录水平表达更高，VEGF-D表达更低，这与临床观察一致。这些发现突出了AS中免疫失调和血管生成失衡的复杂性，揭示了未来研究的潜在生物标志物和治疗靶点。

几项研究发现细胞因子是AS发病机制的核心介质，其中TNF-α和IL-23/IL-17轴被认为是必需的炎症通路。在这些细胞因子中，TNF-α（一种经典的促炎细胞因子）水平在AS中升高，使得TNF-α抑制剂成为EULAR和指南推荐的最有效的一线生物治疗剂。我们的发现与这些报告一致，证实了AS患者中TNF-α水平显著升高。此外，我们发现AS患者血清TNF-β水平增加，这一发现在AS患者中曾有报道。TNF-β在人类软骨细胞中诱导炎症反应；因此，它可能参与AS特征性的炎症性关节损伤，需要进一步的研究来证实这一推测。然而，应进行进一步的研究，包括机制实验，以验证TNF-β在AS中的具体作用。

我们还发现AS患者血清中IL-17家族细胞因子的表达模式不同。IL-17A和IL-17D水平显著升高，而IL-17C水平显著降低。我们研究中观察到的IL-17A水平升高与先前的发现一致，证实了Th17介导的炎症反应在AS发病机制中的核心作用。然而，IL-17D的增加在AS中尚未被广泛报道。这种通过替代受体通路起作用的细胞因子，可能有助于先天免疫激活和炎症细胞招募，正如先前在其他自身免疫性疾病的研究中所提示的那样。相反，IL-17C（一种主要参与粘膜屏障免疫和先天防御的介质）水平的降低可能表明AS中屏障功能受损或先天免疫失调。这些差异细胞因子谱表明IL-17家族成员之间存在复杂的相互作用，提示经典的Th17驱动炎症和失调的先天免疫与AS相关，突出了需要进一步研究其具体作用和相互作用。

趋化因子通过介导白细胞的招募和调节自身免疫性疾病中的炎症反应，在免疫调节中起关键作用。我们发现AS患者血清IP-10/CXCL10、MIP-3α/CCL20和MCP-4/CCL13水平显著更高，而MIP-1α/CCL3和eotaxin-3/CCL26水平显著更低。其中，IP-10/CXCL10是一种介导Th1细胞招募的趋化因子，与慢性炎症性疾病相关。Wang等人报道AS患者血清IP-10水平增加，这与疾病活动指标（如CRP和ESR）正相关，表明血清IP-10可能被视为疾病活动的候选生物标志物。我们的ROC分析证实IP-10具有最高的诊断准确性，表明它可能是一个强大的疾病生物标志物。MCP-4/CCL13水平在某些慢性炎症条件下增加，例如多发性硬化症和RA。MIP-3α/CCL20是我们研究中另一种显著升高的趋化因子，对于招募CCR6⁺ Th17细胞到炎症部位至关重要，并参与各种自身免疫性疾病。血清MIP-3α/CCL20水平的增加可能提示AS中Th17驱动的炎症增强，表明IL-17轴对该疾病至关重要。相反，我们的数据表明MIP-1α/CCL3和eotaxin-3/CCL26水平显著降低。先前的研究报告AS和RA患者血清MIP-1α水平高，在给予抗TNF-α治疗后降低，这与我们的发现不同。这种差异可能反映了疾病阶段、先前治疗或患者队列特征的差异。Eotaxin-3/CCL26主要参与嗜酸性粒细胞招募和过敏反应，其在AS发病机制中的作用已被广泛研究，而我们发现的其减少的新发现突出了改变的嗜酸性粒细胞相关免疫反应的作用。需要涉及多种炎症性疾病的比较研究来评估这些趋化因子对AS的特异性和诊断效用。

几种VEGF家族成员，特别是VEGF-C和VEGF-D的血清浓度较低，而VEGFA和sFlt-1/VEGFR-1在AS患者中较高。VEGF家族成员对血管生成和淋巴管生成具有重要影响，这些过程与自身免疫性疾病相关。VEGF-A水平升高与关节炎病症（如RA和AS）中的病理性血管生成和慢性炎症相关，表明其在驱动持续炎症过程中的