利用三维细胞培养模型探究hAMSCs分泌组通过TNF-α/TGF-β/c-MYC信号通路对HT-29结肠癌细胞的影响及其治疗潜力

《Immunity, Inflammation and Disease》：Investigating the Impact of the Secretome From hAMSCs on HT-29 Colon Cancer Cells via TNF-α/TGF-β/c-MYC Signaling Pathways Using a Three-Dimensional Cell Culture Model

本研究创新性地采用三维培养模型，揭示人羊膜间充质基质细胞（hAMSCs）分泌组通过下调TGF-βR/SMADs/c-MYC通路、上调p15INK4B/p21CIP1及炎症因子（TNF-α/IL-4/6/8），显著抑制结肠癌细胞侵袭与增殖，为干细胞分泌组治疗结肠癌提供了新型理论依据和治疗策略。

　　

背景

结肠癌是全球范围内导致死亡的主要癌症类型之一，现有治疗手段效果有限，亟需开发新型治疗平台。干细胞因其独特的生物活性成为癌症治疗的研究热点，其中间充质基质细胞（MSCs）因其易于分离培养和低免疫原性而备受关注。人羊膜间充质基质细胞（hAMSCs）的分泌组（secretome）包含多种生物活性因子，可能通过调控关键信号通路影响肿瘤行为。本研究重点探讨TNF-α/TGF-β/c-MYC通路在结肠癌进展中的作用，该通路涉及炎症因子、细胞周期调控和上皮间质转化（EMT）过程。

方法

研究采用Transwell共培养系统，将hAMSCs与HT-29结肠癌细胞以1:1比例共培养3天后收集分泌组。通过悬滴法构建三维细胞培养模型形成肿瘤球体（spheroid），模拟体内肿瘤微环境。采用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析TGF-βRI/II、Smad2/3/4、c-MYC、p15^INK4B、p21^CIP1、细胞周期蛋白B1（cyclin B1）、CDK4/6、基质金属蛋白酶9（MMP9）及E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测白细胞介素（IL-4/6/8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平；定量聚合酶链反应（qPCR）分析E-钙黏蛋白和波形蛋白（Vimentin）的mRNA表达；划痕实验（scratch assay）评估细胞迁移能力。数据统计分析采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7软件，独立样本t检验，p<0.05为显著差异。

结果

3.1 TNF-α在球体中的诱导

三维培养模型成功形成HT-29细胞球体，Western blot和ELISA结果显示，经hAMSCs分泌组处理后，HT-29细胞中TNF-α表达显著上调，表明分泌组可激活炎症反应。

3.2 IL-6、IL-8和IL-4在球体中的诱导

ELISA分析显示，hAMSCs分泌组处理后的HT-29细胞中IL-6、IL-8和IL-4水平显著升高，这些炎症因子在癌症进展中通过调节细胞信号转导通路发挥作用。

3.3 分泌组抑制TGF-βRI/II、Smad2/3/4、c-MYC并提升p15^INK4B和p21^CIP1表达

Western blot结果表明，hAMSCs分泌组下调TGF-β受体I/II（TGF-βRI/II）、Smad2、Smad3、Smad4及原癌基因c-MYC的蛋白表达，同时上调细胞周期抑制剂p15^INK4B和p21^CIP1。CDK4/6和cyclin B1表达也被抑制，提示分泌组通过阻断TGF-β/Smad/c-MYC通路诱导G1期细胞周期停滞。

3.4 分泌组通过提升E-钙黏蛋白和抑制波形蛋白、MMP9抑制HT-29癌细胞的上皮间质转化（EMT）

划痕实验显示hAMSCs分泌组显著抑制HT-29细胞迁移。qPCR分析表明E-钙黏蛋白mRNA表达上调而波形蛋白mRNA下调，Western blot证实MMP9蛋白表达降低。这些结果说明分泌组通过逆转EMT过程抑制癌细胞侵袭，表现为上皮标志物增加和间质标志物减少。

讨论

本研究系统阐述了hAMSCs分泌组通过多重机制抑制结肠癌细胞恶性行为。TGF-β通路具有双刃剑作用：早期抑癌而晚期促癌，本研究中分泌组下调TGF-βRI/II及Smad蛋白，进而抑制下游c-MYC并激活p15^INK4B和p21^CIP1，导致细胞周期阻滞。同时，分泌组诱导炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-4的表达，这些因子虽通常促癌，但在本模型中可能与分泌组其他成分协同发挥抑癌作用。EMT过程的抑制进一步证实了分泌组抗侵袭效能，表现为E-钙黏蛋白上升和波形蛋白、MMP9下降。干细胞分泌组包含多种生物分子（如细胞因子、趋化因子、microRNA），其具体效应取决于细胞环境，本研究为hAMSCs分泌组治疗结肠癌提供了实验依据，但TGF-β通路的双重角色及因子间互作需进一步探索。

结论

hAMSCs分泌组通过调控TGF-β/Smad/c-MYC/p15^INK4B/p21^CIP1信号通路，抑制HT-29结肠癌细胞生长和侵袭，同时促进E-钙黏蛋白和炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-4）表达，表明其作为结肠癌治疗新平台的潜力。

作者贡献与利益声明

Fatemeh Safari负责研究设计、实验实施和论文撰写，Mohammad Ali Majdoddin参与数据分析。作者声明无利益冲突，伦理事项无需申报。