溃疡性结肠炎中侵袭性黏膜相关肺炎克雷伯菌的致病潜力：毒力因子特征与炎症反应机制解析

《Immunity, Inflammation and Disease》：Pathogenic Potential of Invasive Mucosa-Associated Klebsiella pneumoniae Isolates in Ulcerative Colitis: Characterization of Virulence Factors and Inflammatory Response

本研究深入探讨了溃疡性结肠炎（UC）患者黏膜来源的肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）的致病机制，通过PCR、细胞黏附/侵袭实验及炎症因子检测，揭示了其毒力基因（fimH、hcp等）富集、促炎因子（IL-8等）上调及免疫通路（NOD1/2、STAT1）激活的关键作用，为UC的病原靶向治疗提供了新视角。

　　

1 引言

炎症性肠病（IBD）包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其发病机制与宿主免疫应答缺陷和肠道微生物群落改变密切相关。肠道菌群失衡（dysbiosis）被认为是IBD发生发展的重要因素，但其在疾病中的因果角色尚未完全明确。近年来，研究焦点从单一病原体转向条件致病菌（pathobionts）的累积效应，其中变形菌门（Proteobacteria）的多种细菌被证实与IBD发病相关。肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）作为一种机会性致病菌，在UC患者肠道黏膜中富集，且其代谢通路与疾病严重程度正相关，但其在UC中的具体致病机制仍待深入解析。

2 材料与方法

2.1 患者与样本

研究经伊朗沙希德·贝赫什提大学医学科学研究院伦理委员会批准，共纳入83例UC患者及年龄性别匹配的非IBD对照。结肠镜检查过程中，从炎症区域采集黏膜活检样本，置于脑心浸液肉汤（BHI）中转运至实验室进行细菌分离。

2.2 细菌分离与鉴定

样本匀浆后接种于麦康凯琼脂平板，37°C有氧培养24小时。挑取粉红色乳糖发酵菌落，经形态学、生化特性及khe基因PCR进行肺炎克雷伯菌鉴定。

2.3 毒力基因检测

采用QIAGEN DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，通过PCR检测kfu、magA、fimH、mrkD、rmpA、ybtS、iutA、iroN、hcp、vgrG等毒力基因。反应条件包括95°C初始变性10分钟，35个循环的95°C 30秒、58°C 45秒、72°C 45秒，最终72°C延伸10分钟。

2.4 细胞系与培养

人结肠腺癌细胞系Caco-2和单核细胞系THP-1分别用于黏附/侵袭实验和巨噬细胞内生存实验。细胞在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养，感染复数（MOI）为10，预处理多黏菌素B以中和LPS效应。

2.5 细胞黏附与侵袭实验

Caco-2细胞以1×10⁵/孔接种24孔板，感染3小时后洗涤、裂解，涂板计算菌落形成单位（CFU）。黏附指数≥1定义为阳性。侵袭实验采用庆大霉素保护法，侵袭指数≥0.1%定义为侵袭性菌株。

2.6 巨噬细胞内生存与复制

THP-1细胞经PMA诱导分化为巨噬细胞，感染后1小时和24小时裂解细胞，计算细胞内细菌存活和复制比率。

2.7 基因表达与细胞因子检测

RT-qPCR检测NOD1、NOD2、STAT1、NF-κB基因表达，以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法分析。ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-8浓度。

2.8 统计分析

使用R软件和GraphPad Prism进行数据分析。分类变量采用Fisher精确检验或卡方检验，连续变量采用t检验及Tukey事后检验，p<0.05视为显著。

3 结果

3.1 细菌分离与毒力特征

从UC患者中分离62株黏膜相关肺炎克雷伯菌，54.8%患者诊断为直肠炎。毒力基因分析显示，ycfM（100%）、hcp（93.5%）、mrkD（93.5%）检出率最高。fimH、hcp、fyuA、irp1在UC组显著高于非UC组（p<0.05）。所有菌株均缺乏rmpA、magA等超毒力标志物，符合经典毒力表型。

3.2 黏附、侵袭与细胞内生存能力

29%的UC分离株显示黏附能力（非UC组仅8%，p=0.005），其中16.1%具备侵袭能力（非UC组3.2%）。8株UC侵袭株可在巨噬细胞内生存并复制。

3.3 免疫基因表达上调

侵袭性UC菌株显著上调Caco-2细胞中STAT1、NOD1、NOD2表达（p<0.001），但NF-κB无显著变化。

3.4 炎症因子释放增强

侵袭性UC菌株诱导IL-8分泌显著高于非侵袭株及非UC株（p<0.0001），IL-6亦有升高，IL-1β无差异。

4 讨论

本研究揭示UC相关肺炎克雷伯菌通过fimH介导的黏附、T6SS（hcp）驱动的侵袭及铁获取系统（fyuA、irp1）增强肠道定植与持久性。侵袭菌株激活NOD1/NOD2-ST