基于环境DNA宏条形码技术的压载水外来物种多样性监测研究

《Ecology and Evolution》：Monitoring Alien Species Diversity in Ballast Water Based on Environmental DNA Metabarcoding

本综述系统阐述了利用环境DNA（eDNA）宏条形码技术监测船舶压载水中浮游植物、无脊椎动物和鱼类多样性的创新方法。研究通过对青岛董家口港六艘船舶的压载水样本分析，成功鉴定出41种外来物种（包括3种入侵物种），揭示了压载水位置和水龄对群落组成无显著影响，但同一船舶不同压载舱之间存在显著差异。该技术为海洋生物入侵的早期预警提供了高效、非侵入性的解决方案，对制定压载水管理政策和生物安全策略具有重要参考价值。

　　

ABSTRACT

本研究首次在中国应用环境DNA（eDA）宏条形码技术对青岛董家口港到港船舶压载水中的浮游植物、无脊椎动物和鱼类多样性进行系统性监测。通过针对18S V4、18S V9和12S区域的三种通用引物组，对来自南海、濑户内海、台湾海峡和黄海等不同海域的六艘船舶的九个压载水样本进行测序分析。

1 Introduction

外来物种通过压载水传播已成为海洋生物入侵的主要途径之一。传统形态学鉴定方法存在工作量大、耗时长且易出错等局限性，而eDNA宏条形码技术通过直接从水环境中提取和测序DNA，为压载水生物多样性监测提供了更高效准确的解决方案。董家口港作为中国重要的枢纽港口，日益增长的船舶流量使得通过压载水引入外来物种的风险显著增加。

2 Materials and Methods

2.1 Sample Collection

2024年2月至6月期间，研究人员在董家口港采集了六艘船舶的压载水样本。使用灭菌的1000毫升棕色塑料瓶进行采样，每个瓶子含有100毫升商业保存溶液。对V5和V6两艘船舶进行了多个压载舱的详细采样，以研究船内生物组成的变异性。

2.2 DNA Extraction and Filtration

使用0.22微米孔径的Sterivex-GP过滤器在实验室条件下进行过滤，并通过DNeasy PowerSoil Pro Kit提取总DNA。对来自单个压载舱的压载水在DNA提取前进行合并，而对同一船舶多个压载舱的样本则独立处理。

2.3 PCR Amplification, Sequencing, and Sequence Analysis

采用三组通用引物进行PCR扩增：靶向真核核糖体大亚基V4和V9区域的引物，以及靶向线粒体12S rRNA基因的引物。使用Illumina NovaSeq平台进行双端测序，并通过DADA2和VSEARCH进行生物信息学分析。

2.4 Data Analysis

2.4.1 Taxonomic Annotations and Species Composition Statistics

使用NCBI核苷酸数据库和MitoFish数据库进行物种注释，并通过WoRMS和AlgaeBase进行交叉验证。排除非目标类群后，保留76个浮游植物、70个无脊椎动物和100个鱼类ASV/OTU。

2.4.2 Diversity Analysis

通过稀释曲线、α多样性指数（Chao1、Shannon、Pielou）、热图和UpSet图评估群落多样性。使用PERMANOVA分析压载水年龄和位置对物种组成的影响，并通过NMDS可视化样本间生态差异。

2.4.3 Alien Species Statistics

重点监测浮游植物、无脊椎动物和鱼类中的外来类群，使用《中国外来入侵物种》确认其入侵状态，并分析其在青岛地区的分布记录和潜在生态经济影响。

3 Results

3.1 Sequencing Results and Species Composition

高通量测序产生大量读长，经过质量控制后获得246个ASV/OTU。浮游植物以硅藻门和绿藻门为主，无脊椎动物优势类群包括盘变形虫门、节肢动物门和纤毛虫门，鱼类则以Cryptopsaras、Anguilla和Regalecus等属为代表。

3.2 Results of Species Diversity Analysis

稀释曲线表明测序深度基本满足多样性检测需求。α多样性指数显示不同船舶和压载舱之间存在显著差异。PERMANOVA分析表明压载水年龄和位置对物种组成无显著影响，但NMDS显示同一船舶不同压载舱之间存在明显分异。

3.3 Monitoring Results of Alien Species

共鉴定出16种外来浮游植物、13种外来无脊椎动物和12种外来鱼类，其中包括三种入侵物种：柄海鞘（Styela clava）、尖吻鲈（Lates calcarifer）和欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）。来自濑户内海的船舶显示出更高的外来物种多样性。

4 Discussion

4.1 Effectiveness of eDNA Metabarcoding for Alien Species Monitoring

本研究证实eDNA宏条形码技术能够有效检测压载水中的外来物种，特别是对稀有和隐蔽类群的监测具有显著优势。多标记策略实现了跨营养级生物多样性的综合评估，为港口生物安全提供了技术支撑。

4.2 Species Composition Characteristics and Factors Influencing Ballast Water Communities

压载水群落通常由少数优势种主导，表现出明显的生态适应性。同一船舶不同压载舱之间的物种组成差异可能源于沉积物再悬浮、微环境变异等因素，强调了多舱采样的重要性。

4.3 Alien Species Risks and High-Risk Source Regions

来自濑户内海的船舶表现出更高的外来物种引入风险。高丰度外来物种（如Regalecus glesne）的重复检测表明其具有较高的入侵潜力，需要优先关注和管理。

4.4 Implications for Ballast Water Management

研究结果强调了基于风险的压载水管理策略的必要性，建议针对高风险来源区域实施更严格的监测和处理措施，同时考虑船舶特异性和舱室变异性的影响。

5 Conclusion

本研究首次系统评估了董家口港压载水外来物种多样性，证实eDNA宏条形码技术在海洋生物入侵早期预警中的应用价值。研究成果为制定科学的压载水管理政策提供了重要依据，对维护海洋生态安全和生物多样性保护具有重要意义。