实蝇科昆虫下颚须嗅觉敏感性的分化进化压力：性信息素与生态位相关气味的选择性驱动

《Ecology and Evolution》：Divergent Evolutionary Pressures Shape Olfactory Sensitivity of the Maxillary Palps in Tephritidae Fruit Flies

本研究通过气相色谱-电触角电位联用技术，系统比较了五种实蝇下颚须对性信息素（spiroacetals）和生态位相关气味（如果实挥发物）的嗅觉敏感性。研究发现，信息素类化合物的检测模式与系统发育高度一致，而食物气味的敏感性则与生态位密切相关，揭示了嗅觉进化中稳定化选择与定向选择的对立压力。该工作为昆虫嗅觉受体功能进化及实蝇类害虫诱剂开发提供了新视角。

　　

摘要

嗅觉是一种快速进化的感官系统。鉴于其功能的多样性——从寻找生态位到选择配偶，研究者假设嗅觉受到分化进化压力的影响。本研究比较了五种实蝇科（Tephritidae）昆虫下颚须对两大类挥发物的嗅觉敏感性：一类是广义的生态位相关挥发物（食物和果实气味），另一类是用于性通讯的信息素（pheromones）和信息素类似物（parapheromones）。通过分析不同物种间敏感性的差异，研究者探寻了这种对比性进化压力留下的“信号”。近年来，研究表明下颚须是检测这两类挥发物的关键辅助嗅觉器官，因此本研究将感官分析聚焦于此。利用气相色谱-电触角电位联用技术，研究者记录了五种系统发育和生态位差异显著的实蝇物种的感官反应。尽管不同物种间的检测范围存在显著重叠，但下颚须在对信息素和信息素类似物的敏感性上表现出明显的性别和支系特异性模式。对信息素和信息素类似物敏感性的聚类分析与物种的系统发育高度一致。相比之下，对普通食物和果实气味敏感性的聚类分析则显示出不同的模式，其与生态位而非系统发育密切相关。显然，塑造对信息素和信息素类似物与生态位相关气味的嗅觉敏感性进化方向的自然选择压力是截然相反的，这让人联想到稳定化选择与定向选择。理解不同挥发物类别的检测和进化机制，为嗅觉的进化生态学、嗅觉受体研究、感官和偏好编码提供了宝贵的见解，并支持了开发新型诱剂以管理这些害虫的合理策略。

1 引言

昆虫占所有已描述物种的80%以上，是多样性最丰富的生物类群。其短暂的世代周期和小体型使昆虫能够迅速入侵新的生态位。这种进化适应性与同样快速进化的嗅觉系统相平行，嗅觉负责检测关键的环境线索，如食物来源和潜在配偶。这在蛋白质水平上体现在嗅觉受体（ORs）上，辐射事件通常反映在ORs的多样化中。然而，ORs序列的多样化是否等同于功能辐射，目前尚不清楚，部分原因是ORs功能表征的滞后。同样，作用于ORs的进化压力是否与其功能无关，也很大程度上未知。但可以设想，作用于检测食物或产卵地点挥发物的选择压力，与检测性通讯信号的选择压力是不同的。本研究通过剖析实蝇下颚须的嗅觉敏感性来探讨这个问题，下颚须对果实和食物气味以及性信号均敏感。

在昆虫中，触角是主要的嗅觉器官，但许多物种也拥有辅助嗅觉结构，如下颚须。嗅觉感器也可能出现在其他解剖区域，例如烟草天蛾的产卵器，那里的感器检测气味分子并可能在生殖行为中发挥作用，以及某些成年鳞翅目昆虫的下唇窝，那里有对二氧化碳敏感的感器。下颚须位于口器近端，与触角相比，其包含的感觉神经元类型数量有限。在果蝇中，下颚须仅包含一种形态类型的嗅觉感器，即锥形感器，具有三个亚型，每个亚型容纳两种嗅觉感觉神经元（OSNs）。类似地，在实蝇科中，下颚须表达三种锥形感器亚型，每种亚型容纳两个感觉神经元。由于靠近取食基质，下颚须被推测在检测食物相关气味方面发挥着不成比例的作用，补充了触角更广泛的嗅觉功能。尽管这在果蝇中并不明显，但在实蝇科中，下颚须对食物气味的敏感性高于对果实气味的敏感性。

除了对果实和食物气味敏感外，实蝇科的下颚须也对螺环缩酮类化合物敏感。这类化合物由果实蝇属物种的直肠腺产生，由于它们介导性行为，被公认为实蝇科的信息素。然而，它们尚未在蜡实蝇属物种中被报道。螺环缩酮被果实蝇属的几种实蝇的下颚须检测到，但关于其他物种的检测情况知之甚少。鉴于螺环缩酮的多样性以及性别间的差异，比较感官研究将有助于理解这些信息素是如何被检测的、其检测机制是如何进化的，以及嗅觉输入如何转化为行为。

下颚须敏感的另一类化合物是苯丙烷类化合物。苯丙烷类化合物来源于植物，通常吸引雄性。鉴于其强烈且偏向雄性的吸引力，它们通常被称为信息素类似物。信息素和信息素类似物被广泛用于几种实蝇的监测和控制。例如，甲基丁香酚用于对物种进行大量诱捕、诱杀和监测；悬钩子酮及其合成类似物诱蝇酮用于监测物种。蜡实蝇属物种似乎不被苯丙烷类化合物吸引，但另外两种雄性引诱剂，乙酸松油酯和合成氯化特诱酯，分别在对蜡实蝇和地中海实蝇的监测和控制中发挥类似作用。除了检测，下颚须对于几种实蝇朝向信息素类似物的定向也至关重要，这在果实蝇中的切除实验中得到了证明。

在本研究中，我们使用联用气相色谱电触角电位检测技术评估了来自系统发育和生态多样性实蝇物种的雄性和雌性下颚须的反应。我们研究了多种实蝇物种下颚须的嗅觉敏感性。这些包括橘小实蝇，一种多食性的严重园艺害虫，释放螺环缩酮并被甲基丁香酚吸引；辣椒实蝇，一种茄科专性害虫，其雄性被异佛尔酮吸引，并产生与橘小实蝇相同的螺环缩酮，以及另一种螺环缩酮；以及瓜实蝇，一种葫芦科专性害虫，被悬钩子酮/诱蝇酮吸引，并且是已知的螺环缩酮生产者。我们还包括了两种多食性的蜡实蝇属物种：地中海实蝇和蜡实蝇，它们分别被特诱酯和乙酸松油酯吸引。然而，这两种蜡实蝇属物种均未观察到产生螺环缩酮。刺激物列表还包括苯丙烷类、酯类、吡嗪类和酚类等化合物，这些化合物是根据文献选择的。使用合成化合物结合GC-EPD还可以消除使用非GC方法时可能出现的由杂质引起的假阳性。这些数据为了解下颚须的检测及其在介导对特定化合物的性别分化行为反应中的进化作用提供了见解。最后，由于这些化合物在害虫控制中很重要，了解它们如何被检测可能为它们在害虫管理中的应用提供有价值的见解。

2 材料与方法

2.1 昆虫

实验蝇种的实验室种群通过从国际昆虫生理生态中心和国际原子能机构获得的蛹建立。羽化的成虫被饲养在聚酯网笼中，条件受控，并提供食物和饮水。

2.2 化学品

使用的真实化学标准品总结在表中。大多数化合物购自Sigma-Aldrich，其他来自不同来源，可在瑞典农业科学大学的本地化学库中获得。螺环缩酮由Wittko Francke教授合成。

2.3 合成混合物

构建了三个混合物，共包含40种合成化合物。一些化合物，如螺环缩酮、雄性引诱剂等，是根据实蝇和果蝇的文献数据选择的。其他化合物要么根据我们未发表的工作已知能引起反应，要么其结构与雄性引诱剂或已报道的螺环缩酮有相似之处。还包括了从果实和发酵中发现的、在实蝇下颚须中能引起强烈反应的额外化合物，以便将观察结果锚定在先前的工作中。因此，这些混合物具有多样性，包含酯类、萜类、螺环缩酮、吡嗪类、酚类和苯丙烷类化合物。

化学标准品在混合前进行分析，使用气相色谱-质谱联用仪，配备极性DB-WAX色谱柱，以氦气为载气，不分流模式进样。炉温程序如下：50°C保持1.5分钟，以7°C/分钟升温至250°C，保持5分钟。较低浓度用于分离化合物，较高浓度用于区分对合成物和杂质的反应。主要杂质被初步鉴定，主要化合物使用NIST 20库和NIST MS Search v. 2.4以及已发表的Kovats保留指数进行确认。几种合成化合物，如法尼烯，由于含有大量杂质，在此步骤中被排除，未纳入最终的40种化合物。构建了三个混合物，确保合成物的峰不重叠，并再次注入GC-MS进行验证。还注入了C7-C30的脂肪烷烃溶液以计算Kovats保留指数。

2.4 电生理实验

使用气相色谱联用火焰离子化检测器和电触角电位检测器记录五种实蝇下颚须的嗅觉反应。记录时，将昆虫固定在一个200微升的微量吸头中，下颚须暴露在外。使用充满Beadle-Ephrussi林格溶液的玻璃毛细管电极，记录下颚须远端相对于头部参考电极的信号。在10 ng/μL浓度下测试三种混合物，使用GC-EAD 2014软件采集信号。气相色谱配备DB-WAX色谱柱，流出物在FID和EPD之间平均分流。使用10-20天龄的雄性和雌性个体进行三种混合物的测试，每次试验注入2 μL，并且在很大程度上，同一只个体上进行了跨混合物的记录。对于每种混合物，根据整个运行过程中的记录质量，使用三到七次记录。通过比较GC-EPD与GC-MS和已发表文献的Kovats保留指数，确认了GC-EPD活性峰。

2.5 分析

电生理数据使用GC-EAD软件进行注释并导出为CSV文件。数据随后被添加到Google Sheets中，每个混合物一个工作簿，每个物种一个工作表。数据使用“googledrive”包读入R。EPD反应作为相对值进行分析，以解释个体间和物种间电学特性的差异。原始毫伏读数进行对数转换，并为每个实验组计算基线。绝对值按此基线缩放，并进一步通过除以平均缩放反应进行归一化，产生最终的相对度量。使用单因素方差分析检验每种化合物的物种差异，随后在适当情况下进行事后Tukey HSD检验。使用独立样本t检验评估每个物种-化合物组合内的性别差异。所有p值均使用Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正。化合物使用webchem针对PubChem进行解析，并对注释差异进行质量控制。未知化合物被命名为“unknown”加上其保留指数。每种化合物的生物合成途径通过NPClassifier的API使用SMILES进行解析，螺环缩酮除外，它们是手动标记的。针对酯类、莽草酸途径和苯丙烷类化合物以及螺环缩酮这三种主要途径，构建了所有昆虫物种 pairwise 组合的线性模型。使用“vegan”包中的Jaccard相异指数构建了反应的树状图。通过连接16S和COI基因序列构建了系统发育分析，使用Virgilio等人的数据子集，以Acanthiophilus helianthi作为外群；使用MAFFT对齐序列，并使用“iqtree2”构建一致树。所有树状图均使用Yu等人的“ggtree”进行绘制，所有其他绘图和数据操作均使用“tidyverse”包进行。

3 结果

橘小实蝇、辣椒实蝇、瓜实蝇、地中海实蝇和蜡实蝇的下颚须检测到了40种合成化合物中的32种，并持续对另外36种杂质化合物产生反应，其中34种无法可靠鉴定。化合物通常被两性检测到，检测重叠范围从辣椒实蝇的87.5%到瓜实蝇的68%。仅被单一性别检测到的化合物的反应 consistently 较弱。

在所有物种中，引起最强反应的三种化合物要么是螺环缩酮，要么是苯丙烷类化合物。然而，这些化合物在不同物种间存在差异：对于橘小实蝇，最强的反应由螺环缩酮D、诱蝇酮和olean引起；而对于辣椒实蝇，则由诱蝇酮、姜酮和悬钩子酮引起；对于瓜实蝇，则由螺环缩酮C、螺环缩酮A和诱蝇酮引起。两种蜡实蝇属物种对甲基丁香酚和4-乙基愈创木酚反应最强，其次是地中海实蝇对olean和杂质二氢甲基丁香酚的反应，以及蜡实蝇对olean和杂质二氢甲基丁香酚的反应。

所有物种都检测到脂肪酰基庚-2-酮，除辣椒实蝇外，所有物种都检测到1-辛烯-3-醇。虽然瓜实蝇检测到三种脂肪酯，但所有其他物种检测到六种。吡嗪类化合物仅被橘小实蝇、地中海实蝇和蜡实蝇检测到。橘小实蝇和地中海实蝇从莽草酸途径和苯丙烷类途径中检测到的化合物最多，分别为11种和10种，而所有其他物种检测到9种。只有两种果实蝇属物种检测到石竹烯，而瓜实蝇和两种蜡实蝇属物种检测到异佛尔酮。除瓜实蝇外，所有物种都检测到β-月桂烯。相比之下，以下化合物未被任何物种的下颚须检测到：DMNT、丙酸-2-苯乙酯、3-甲基丁酸-2-甲基丙酯、3-羟基-2-丁酮、柠檬烯、特诱酯、α-乙酸松油酯和β-罗勒烯。

3.1 对螺环缩酮的敏感性

五个物种对面板中的八种螺环缩酮表现出重叠和差异性的下颚须反应。两种最简单的螺环缩酮形式，olean和螺环缩酮A，被所有物种和两性检测到。蜡实蝇检测到的螺环缩酮数量最少，只有olean和螺环缩酮A。另一方面，瓜实蝇检测到除螺环缩酮F之外的所有螺环缩酮。橘小实蝇和辣椒实蝇检测到相同的六种螺环缩酮，尽管反应强度不同。值得注意的是，螺环缩酮B在所有物种中引起的反应较弱，除了不检测该化合物的蜡实蝇。一些螺环缩酮仅被少数物种检测到，例如螺环缩酮C，仅被瓜实蝇和地中海实蝇检测到，分别引起强和弱反应。此外，两种果实蝇属物种对螺环缩酮D的反应最强，其次是olean。螺环缩酮D和螺环缩酮G被瓜实蝇、辣椒实蝇和橘小实蝇检测到。虽然螺环缩酮F仅被两种果实蝇属物种检测到，但只有瓜实蝇检测到螺环缩酮E。螺环缩酮E、F和G是2-乙基-8-甲基-1,7-二氧杂螺[5.5]十一烷的外消旋异构体，其手性无法解析。

3.2 对苯丙烷类化合物的嗅觉敏感性

对于一些雄性引诱剂化合物，检测到显著的种间差异，但没有任何物种-化合物组合存在基于性别的差异。对于甲基丁香酚，事后检验表明瓜实蝇的反应显著弱于蜡实蝇，与橘小实蝇和地中海实蝇相比有非显著的趋势。与此一致，对甲基丁香酚反应强烈的三个物种也对类似的化合物如丁香酚和杂质二氢甲基丁香酚敏感，而瓜实蝇和辣椒实蝇不检测这些。相比之下，姜酮被所有物种检测到，但敏感性存在显著差异。橘小实蝇和辣椒实蝇的反应强于瓜实蝇和蜡实蝇。未观察到悬钩子酮或诱蝇酮的种间差异，它们仅被两种果实蝇属物种和瓜实蝇检测到。特诱酯和乙酸松油酯未被任何物种检测到。此外，只有瓜实蝇和两种蜡实蝇属物种检测到异佛尔酮。

3.3 实蝇下颚须对螺环缩酮、苯丙烷类化合物和酯类嗅觉敏感性的相关性

物种间的比较表明，橘小实蝇和辣椒实蝇在下颚须反应的范围和强度上存在显著相关性。类似地，地中海实蝇和蜡实蝇在苯丙烷类化合物和螺环缩酮方面也显著相关。虽然在橘小实蝇/辣椒实蝇和蜡实蝇/地中海实蝇之间发现了许多酯类和螺环缩酮的相关性，但瓜实蝇和蜡实蝇/地中海实蝇之间没有观察到相关性。

最后，基于五种物种对信息素和信息素类似物EPD反应的Jaccard相异指数构建的一致树，与基于线粒体和核糖体DNA推导的系统发育树高度一致；而基于对普通气味EPD反应构建的树则形成独立的聚类，该聚类与其生态位相关。

4 讨论

实蝇科的下颚须正受到越来越多的研究，从OSN形态学到使用EPG和EPD的功能研究。这种日益增长的关注尤其源于发现实蝇的下颚须介导了对信息素和信息素类似物的检测和吸引，这些物质在监测和控制中很重要。然而，实蝇下颚须的感受范围比信息素和信息素类似物更广，包括对果实和食物挥发物的强烈反应。

实蝇下颚须的气味检测，具有对普通气味和诱导性别分化行为的气味的敏感性，似乎服务于多种生态功能，可能涉及分离的神经处理通路。虽然两类气味都激活下颚须OSNs，但信息素和信息素类似物可能参与保守的侧角回路，驱动硬连线的吸引行为，而食物气味可能整合到蘑菇体网络中，用于情境依赖的估值。这些功能差异可能使下颚须检测系统受到不同的选择压力。对于食物气味，定向选择可能优化对主要寄主挥发物的敏感性，而稳定化选择可能由于信息素和信息素类似物的繁殖意义而保留对其的高亲和力受体。时间生态位分区可能最大限度地减少这些气味类别之间的掩蔽效应。

当前研究表明，虽然下颚须确实对果实和食物气味有反应，但它们对信息素和信息素类似物特别敏感，其广度和对不反映行为敏感性的分类群的交叉敏感性令人惊讶。此外，聚类分析表明，对信息素类似物的反应 closely followed 系统发育而非生态学，从而不同于果实和食物气味的敏感性，后者 followed 生态学而非系统发育。

4.1 对雄性引诱剂或信息素类似物的敏感性

果实蝇属和瓜实蝇属物种通常根据其对苯丙烷类化合物的行为反应分为三类：甲基丁香酚反应型、悬钩子酮/诱蝇酮反应型和非引诱剂反应型。下颚须微电路仅由六种OSN类型组成，其中几种介导对化学多样性广泛的果实和食物气味的反应，介导苯丙烷类化合物反应的OSN类型数量必然非常有限。可能只有一种OSN类型检测苯丙烷类化合物，因此反应可能反映了单一OSN的调谐广度，该OSN在介导雄性吸引中至关重要。

然而，令人惊讶的是，下颚须对苯丙烷类化合物的敏感性并不总是与行为敏感性一致。这些明显的不匹配应谨慎解释。我们的电生理测定单独测试化合物，而自然的信息素类似物信号通常以多组分混合物的形式出现，具有精确的比例，决定行为效价。因此，对单个化合物的外周神经元放电并不一定预测吸引，因为高级嗅觉中枢的中心处理最终决定行为输出。

因此，虽然下颚须在介导对雄性引诱剂的行为反应中很重要，但下颚须的调谐与对信息素和信息素类似物的行为敏感性不匹配。由于下颚须敏感性与触角敏感性重叠，似乎合乎逻辑的是，为了引发导致陷阱捕获的完整行为序列，需要两个器官的输入，并且这种输入组合也赋予了行为特异性。确实，下颚须和触角的组合对于橘小实蝇和瓜实蝇对雄性引诱剂的强烈行为反应似乎至关重要。同样，辣椒实蝇的下颚须未检测到异佛尔酮，这是一种已报道的雄性引诱剂，但其对辣椒实蝇的吸引力远不如甲基丁香酚对橘小实蝇的吸引力。类似地，特诱酯和α-乙酸松油酯未被下颚须检测到，并且作为蜡实蝇属物种的引诱剂效果不如甲基丁香酚对橘小实蝇有效。为了完全理解下颚须对各种化合物的反应如何导致行为，对触角电路的扎实理解似乎很重要。

4.2 螺环缩酮

尽管物种产生的螺环缩酮不同，但下颚须的敏感性似乎独立于此而重叠。例如，本研究中测试的最简单的螺环缩酮olean被所有物种检测到，尽管olean未在这些物种中报道。类似地，螺环缩酮A和螺环缩酮B也被所有或几乎所有物种检测到，而螺环缩酮尚未在实蝇科中报道。螺环缩酮C是一种广泛存在的螺环缩酮，常见于果实蝇属和瓜实蝇属物种中，但仅被瓜实蝇和轻微地被地中海实蝇检测到，而其立体异构体和不常见的螺环缩酮D被橘小实蝇和辣椒实蝇检测到。螺环缩酮E、F和G是2-乙基-8-甲基-1,7-二氧杂螺[5.5]十一烷的外消旋混合物，从几种果实蝇属物种中鉴定出来，在五个物种中诱导了镶嵌的敏感性模式，表明手性对受体敏感性的差异效应。在此背景下，重要的是要注意螺环缩酮不仅是实蝇科熟知的信息素，而且在整个昆虫纲中广泛报道。这可能表明昆虫中存在一个根深蒂固、古老的用于螺环缩酮的OSN和OR系统，并且鉴于其在昆虫谱系间的丰度和重叠产生，其行为特异性可能低于“信息素”一词的内涵所暗示的。进一步的研究应关注OSNs、其 underlying 螺环缩酮反应的ORs，以及OSNs和ORs对各种螺环缩酮和酚类化合物的交叉敏感性。此外，鉴于蜡实蝇属物种的敏感性，在该属及相关属中潜在产生螺环缩酮的可能性似乎值得研究。

4.3 EPD对信息素和苯丙烷类化合物的反应与系统发育一致

先前的研究表明，生态学在触角整体嗅觉组对普通果实和食物气味的调谐中具有压倒性的重要性。本研究提供的证据表明，尽管存在系统发育距离，但对这些普通气味的感官反应在具有相似生态位的物种间高度相似，即使它们系统发育上遥远。然而，对信息素和信息素类似物的反应出现了截然相反的模式，其反而与系统发育亲缘关系密切匹配。

显然，对立的选择压力塑造了嗅觉电路，要么针对生态位气味，导致显示出与生态学相关的模式的定向选择，要么针对介导信息素和信息素类似物通讯的气味，导致某种形式的稳定化选择，从而遵循系统发育。这种对比模式跨越了实蝇科数千万年的嗅觉进化，并且通过GC联用的嗅觉组测量浮现出来，这提供了大量气味剂的嗅觉敏感性总和。确实，这种相关性先前尚未从OSNs或ORs的其他功能研究中报道过。除了揭示ORs的进化生态学模式外，这些进化相关性可用于指导OR研究。鉴于下颚须中表达的ORs数量有限，可以利用对立选择压力来梳理哪些下颚须ORs推定响应普通气味，哪些响应信息素和信息素类似物。基于不同的选择压力，可以预期信息素和信息素类似物敏感ORs的序列比普通气味敏感ORs更严格地遵循系统发育。此外，这可能为参与配体结合并产生这些差异反应的氨基酸序列提供见解，特别是在遵循系统发育的大量序列信息中处于定向选择下的ORs。

5 结论与进一步研究

实蝇科下颚须的功能表征为了解信息素和信息素类似物的基础电路提供了重要见解，以及检测如何可能或不可能引导行为朝向这些化合物。下颚须对信息素和信息素类似物的检测似乎不是行为敏感性的指示。虽然这支持了行为反应依赖于下颚须和触角输入协同作用以介导完整行为范围的观点，但也提出了这种协同作用如何介导以及哪些OSN/OR组合负责这种整合的问题。进一步感兴趣的问题包括，例如，这种子电路是否存在于无反应物种或无反应性别中，以及是否可以通过迄今未描述的气味组合来激活它们，这些组合诱导属于该电路的OSN类型的反应。这些数据还为不同的选择压力如何塑造嗅觉敏感性的进化以及其遵循生态学或系统发育提供了新的见解。出现的模式可能有助于进一步揭示哪些ORs underlying 对哪些气味的反应，并通过指示可能参与配体结合的推定序列来指导未来破译OR功能的研究。最后，了解下颚须的敏感性可用于设计新的气味组合，以便在田间试验中进行测试。