饮食与系统发育如何影响两种鹿科动物的肠道微生物组响应机制

《Ecosphere》：Food or family? How gut microbes respond to diet and phylogeny in two deer species

本刊推荐：这项研究通过独特的同园实验设计，揭示了在控制早期经验条件下，饮食特征（颗粒饲料vs天然植物）和物种差异（骡鹿与白尾鹿）对胃肠道（GI）微生物群落（16S rRNA测序）的共同影响。研究发现，α和β微生物多样性及群落组成随饮食变化显著，且两种鹿的微生物群落对饮食变化的响应存在差异，尤其在选择不同天然植物饮食时最为明显。研究强调了快速饮食变化对GI微生物群落的潜在干扰，以及高质量、多样化饲料对野生反刍动物健康的重要性。

　　

引言

脊椎动物食草动物需要共生的胃肠道（GI）微生物来从纤维化且有时有毒的植物饮食中提取能量和营养。由于GI微生物在相对丰度、功能和专化程度上存在差异，微生物群落既取决于所消耗植物的特性，也取决于食草动物宿主的解剖、生理和行为特征。为了厘清饮食和食草动物系统发育对微生物组的相对贡献，研究人员利用了一个独特的研究系统：骡鹿（Odocoileus hemionus）和白尾鹿（O. virginianus）从新生儿期到成年期在相同条件下以颗粒饲料人工饲养，然后在春季用2周时间过渡到在同一栖息地一起觅食的自然植物饮食，并在夏末重新过渡回颗粒饲料。

胃肠道微生物群落通常以一个具有广泛功能冗余的核心群落为特征，其中许多不同的微生物可能扮演相同的角色。这种冗余创造了一个更具恢复力的群落，可以在干扰（如疾病、快速饮食变化）后保持功能，并增强对宿主的其他服务性能，例如解毒作用。微生物亚群落空间分离、世代时间短且能水平转移基因，这使得瘤胃微生物群落能够通过从这些亚群落重新接种，快速适应食物可用性和动物饮食营养质量的快速变化。然而，当饮食变化过于剧烈或过快时，微生物组可能无法足够快地适应，导致酸中毒和瓣胃积食等疾病。

微生物组不仅对食草动物宿主的饮食做出响应，而且还随宿主进化史的特征而变化。最基本的解剖学差异是发酵室的位置和形态，尤其是相对于胃的位置。拥有前肠发酵室（如反刍动物、袋鼠科有袋动物）的物种通常与仅依赖后肠发酵的物种具有不同的微生物群落组成。即使在宿主的消化道内，微生物群落也可能不同。例如，在驯鹿、野牛和林鼠中，前肠、盲肠和结肠群落在纤维素降解和PSM解毒中扮演不同角色。

最后，微生物群落可能因食草动物物种甚至个体而异，这取决于作为新生儿定植于胃肠道的微生物的最初来源。GI微生物群落的建立取决于母亲的微生物组和行为、动物出生的环境以及同种个体的存在。在生命的最初几周，当新生反刍动物主要消耗乳汁时，瘤胃尚未功能化。随着个体摄入水、植物和土壤并与环境、母亲和同种个体互动，瘤胃变得厌氧并支持微生物的定植。日粮中引入草料进一步增强了微生物群落，特别是那些消化细胞可溶物的微生物。

方法

为了比较饮食和鹿种间的GI微生物组，研究人员采用同园实验设计，让两个同属鹿种的个体在夏季随着在不同围栏间移动，经历五个饮食阶段。这些阶段包括起始饮食、过渡前饮食、自然饮食、过渡后饮食和结束饮食，其可用颗粒饲料和天然草料的比例各不相同。12头鹿羔——6头骡鹿和6头白尾鹿——在华盛顿州立大学的野生有蹄类动物设施（WUF）中在相同的环境条件下进行瓶饲，以确保接触微生物、饮食和学习经历的相似性。

主要的同园实验于2016年5月20日开始，当时人工饲养的鹿为1-2岁，正在WUF消耗其颗粒饲料（即起始饮食，80%颗粒饲料）。在5月25日至6月2日期间，为鹿提供了逐渐增加的补充浏览物，并减少了颗粒饲料的量。2016年6月2日，动物被运送到位于华盛顿州东北部科维尔国家森林的黄松和花旗松林研究区内的一个0.5公顷围栏中。在过渡前饮食阶段，它们在接受森林林下植物喂养的同时，颗粒饲料的摄入量至少减少了7天。接下来，从6月7日到8月2日，动物们大约每5天一起在五个临时围栏（称为自然饮食）之间移动，在那里它们共同居住，只以天然浏览物为食，无法获得颗粒饲料。2016年8月5日，鹿被运回WUF，在那里它们接受了过渡后饮食，包括随意取用的颗粒饲料和补充的天然草料，为期7天。到8月12日，动物进入结束饮食阶段，只提供颗粒饲料、苜蓿干草和牧草，为期6天。

在自然饮食阶段，测量了每种鹿每天摄入的草料的成分、生物量和营养质量，以及饮食成分、饮食质量、采食率和每日觅食时间。为了采样粪便微生物组，在每个饮食阶段跟踪鹿直到其排便，并用无菌手套从每个围栏中的每头鹿收集新鲜粪便颗粒。总共收集并分析了90个样本。使用针对V4区域的16S rRNA基因扩增子测序分析每个粪便样本的微生物群落组成，以分析α和β多样性。

为了研究饮食成分、多样性和营养成分对鹿微生物组的影响，研究人员首先假设鹿在起始和结束饮食阶段摄入≥90%的颗粒饲料，在过渡前和过渡后饮食阶段摄入≥50%的颗粒饲料。从它们消耗的天然草料和颗粒饲料中计算了几个饮食指标。这些包括每种鹿在植物物种和功能组水平的饮食成分、植物物种丰富度和香农-维纳多样性指数。模拟饮食经过冷冻干燥并研磨以通过1毫米筛网进行营养分析。使用连续洗涤剂分析量化了每种模拟饮食的中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤木质素（ADL）和酸不溶灰分。使用碳氮分析仪测定氮含量，并通过将氮含量乘以6.25计算粗蛋白含量。还使用弹式量热仪测定了每种模拟饮食和草料物种的总能含量。从总能含量乘以干物质消化率（DMD）计算了所有样本的日粮可消化能（DE）。此外，使用单宁特异性蛋白结合能力测定了样品中单宁的蛋白结合活性。

结果

由于一些鹿在饲养试验早期被移除，研究人员从分析的90个样本中排除了4个，最终分析了来自8头鹿的86个新鲜粪便样本。两种鹿粪便微生物群落的α多样性指标受到饮食阶段、饮食中植物功能组、饮食营养成分和鹿种的影响。微生物丰富度对鹿种、饮食阶段以及两者之间的交互作用有响应。骡鹿的微生物丰富度在过渡前饮食中最高，而在结束饮食和自然饮食中较低。相反，白尾鹿的微生物丰富度在过渡前饮食中最低，而在结束饮食中最高，并且在自然饮食中也低于结束饮食。另一方面，香农指数对鹿种和饮食阶段的交互作用有响应，但不受饮食阶段或鹿种主效应的影响。Tukey检验表明白尾鹿在不同饮食阶段间没有差异，但骡鹿有差异。骡鹿的香农指数在过渡前饮食中最高，而在结束饮食和自然饮食中较低。

鹿消耗的饮食多样性也影响了其粪便微生物群落的多样性和丰富度。粪便微生物丰富度受到鹿种和饮食丰富度交互作用的影响。具体而言，白尾鹿的粪便微生物丰富度对饮食丰富度有响应。研究人员还发现，粪便微生物群落的香农指数受到鹿种以及物种与饮食香农指数交互作用的影响。当按鹿种分别运行GLM时，发现饮食香农指数对骡鹿的粪便微生物香农指数没有影响，而白尾鹿的粪便微生物香农指数随着饮食香农指数的增加而降低。

粪便微生物多样性还受到起始、结束和过渡饮食中颗粒饲料相对贡献度以及自然饮食阶段不同植物功能组的影响。增加饮食中颗粒饲料的比例提高了白尾鹿的粪便微生物丰富度和香农指数，但对骡鹿的粪便微生物组没有影响。饮食中草本植物的比例降低了白尾鹿的粪便微生物丰富度，但提高了骡鹿的粪便香农指数。最后，常绿灌木的比例降低了白尾鹿的粪便微生物丰富度和香农指数，但对骡鹿没有影响。其他植物功能组对两种鹿的粪便微生物香农指数或丰富度均无影响。

饮食的营养成分对不同程度的两种鹿的微生物群落产生影响。NDF不影响骡鹿的粪便微生物组，但增加了白尾鹿的粪便微生物丰富度；而ADL不影响白尾鹿，但增加了骡鹿的粪便微生物丰富度。可消化蛋白不影响骡鹿，但增加了白尾鹿的粪便微生物丰富度和香农指数。最后，单宁降低了白尾鹿的粪便丰富度和香农指数，但对骡鹿的粪便微生物组没有影响。

与α多样性类似，粪便微生物组的β多样性对鹿种和饮食都有响应。饮食阶段、鹿种以及鹿种与饮食阶段的交互作用影响了粪便微生物群落的β多样性。白尾鹿的β多样性对饮食阶段没有响应，但骡鹿的微生物群落在不同饮食阶段间出现分化。与第一个食物假设（相同饮食-相同微生物）相反，鹿在结束饮食时的粪便β多样性与起始饮食、过渡前饮食和过渡后饮食不同。自然饮食时的粪便β多样性也与过渡前和过渡后饮食不同。使用Bray-Curtis距离进行排序的主坐标分析（PCoA）的前两个轴解释了两种鹿粪便β多样性变异的20%。研究发现基于饮食阶段的明显聚类，尤其是对于骡鹿。ANOSIM显示每组之间存在显著差异。

总体而言，研究人员仅检测到白尾鹿和骡鹿之间以及跨饮食阶段的粪便微生物类群组成的适度差异。在个体从圈养颗粒饮食过渡到天然浏览饮食再返回的过程中，鉴定出的前10个门中，前三个门是两种鹿共享的，即厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门。厚壁菌门约占跨鹿种和饮食阶段的相对丰度的70%。拟杆菌门约占其余的15%。此外，在科水平上，白尾鹿和骡鹿共享按相对丰度鉴定出的前三个微生物科。然而，接下来17个排名前20的微生物科的相对丰度顺序存在一定程度差异。一个科仅在白尾鹿的前20个类群中发现，三个科仅在骡鹿的前20个类群中发现。总的来说，排名前三的微生物科（颤螺旋科、毛螺旋科和克里斯滕森菌科）在鹿处于自然围栏时比消耗部分颗粒饲料时更为丰富。接下来的两个科（拟杆菌科、普雷沃菌科）在自然饮食时的相对丰度低于一个或多个其他饮食阶段。相对丰度仅在颤螺旋科上在白尾鹿和骡鹿之间存在差异，并且仅在过渡后和结束饮食时，骡鹿的每个微生物科的相对丰度更高。

讨论

实验证明，同属的骡鹿和白尾鹿的GI微生物群落对饮食特征和物种差异均有响应。正如预期，当鹿消耗颗粒饲料与天然浏览物时，α和β微生物多样性以及微生物组成存在差异，并且随其他饮食特征（包括植物多样性、某些植物功能组的组成和营养成分）而变化。两种鹿的微生物群落对饮食变化的响应不同，但在选择适度不同的天然植物饮食时响应最为明显；因此，结果最符合不同饮食-不同微生物假说。然而，由于物种和饮食对微生物组之间可能存在由先天行为介导的交互作用，不能排除不同物种-不同微生物假说。

虽然GI微生物组对鹿消耗的饮食做出响应，但结果在某种程度上与食物相关假说有所偏离。正如预期，两种鹿在起始和结束饮食时的粪便微生物香农指数、α丰富度和β多样性相似，前五个微生物科的相对比例也相似。然而，并未观察到预期的随着鹿从起始饮食的定量颗粒饲料转向自然饮食的多样化植物再回到结束饮食的颗粒饲料，微生物多样性先增加后减少的模式。相反，在过渡前饮食中发现了粪便香农指数和丰富度的最大差异，其中骡鹿的微生物多样性最高，而白尾鹿最低，此后骡鹿的微生物多样性下降并保持低位，而白尾鹿则增加并保持高位。白尾鹿的粪便β多样性在饮食间没有差异，但骡鹿的过渡前饮食与起始和结束饮食不同，并且自然饮食显示出骡鹿明显的PCoA聚类和白尾鹿不太明显的聚类。向更高纤维饮食的快速转变会导致瓣胃中未发酵纤维的积累，尤其是在小型浏览反刍动物中。另一方面，如果反刍动物突然转向富含可消化和可发酵底物（如淀粉和糖）的浓缩颗粒饮食，它们可能会遭受瘤胃酸中毒。

虽然不同饮食-不同微生物假说基于自然饮食阶段更多样化的食物种类会导致更多样化的微生物组这一假设，但微生物多样性可能反而对颗粒饲料相比天然草料更高的可消化能和蛋白质做出了响应。营养物质在微生物多样性中的作用也得到观察结果的支持，即当白尾鹿摄入更有营养的食物时，其微生物多样性增加。增加膳食蛋白质可增强微生物多样性，并增加参与氨基酸代谢的微生物的相对丰度。白尾鹿的饮食多样性与微生物多样性之间的负相关也可能反映了这种响应。由于夏季高消化率草料的可用性，快速生长的微生物可以利用细胞可溶物、淀粉和蛋白质。观察到随着饮食多样性增加，微生物多样性降低，可能是由于微生物群落向这些快速生长微生物的比例增加所解释的。如果更大的微生物多样性通过高功能冗余提高了微生物群落从有害饮食变化中的恢复力，那么促进野生反刍动物高质量草料的管理行动可能超越简单的能量学而增强宿主健康。

虽然微生物多样性未遵循预测模式，但以天然饮食喂养的鹿的微生物群落要么具有五个最丰富细菌科中每个科的最高或最低相对丰度，表明微生物组成从颗粒饲料到天然植物饮食再返回发生了变化。颤螺旋科、毛螺旋科和克里斯滕森菌科的相对丰度在鹿消耗自然饮食时最高。这些发现与厚壁菌门具有最广泛的多糖降解能力，并且在消耗以草料为基础的饮食的家畜物种中比标准谷物和干草饮食更为丰富是一致的。与厚壁菌门相反，拟杆菌门，包括普雷沃菌科和拟杆菌科，在鹿消耗自然饮食时最低。自然饮食上拟杆菌门丰度较低而厚壁菌门丰度较高，这与之前的研究发现一致。然而，自然饮食上普雷沃菌科丰度较低令人惊讶，因为它与梅花鹿中的单宁降解有关。

由于使用粪便样本作为整个胃肠道的替代物，结果可能会错过在到达结肠并形成粪便样本之前已在皱胃和小肠中被消化的关键发酵科。因此，更深入地了解GI微生物响应饮食的成分变化需要（1）对整个GI道进行采样；（2）针对细菌功能进行靶向全基因组宏基因组研究；（3）GI和其他微生物之间相互作用的群落分析。

研究人员还提出了三个关于两种相关鹿种在同一环境中一起觅食时，其微生物群落如何因饮食和系统发育差异程度而不同的替代假说。预测微生物群落的主要差异将反映饮食差异而非物种间的系统发育差异；因此，预期即使在自然饮食上，饮食差异对微生物组的影响也最小。在自然饮食上，两种鹿的饮食约有一半由落叶灌木组成，另外四分之一是草本植物。常绿灌木、禾本科植物、针叶树、蕨类植物、地衣和蘑菇也被消耗，但每个这些植物功能组占其总饮食的比例均小于10%。因此，结果更符合第二个替代假说（不同饮食-不同微生物）。由于在起始和结束饮食时，鹿消耗它们被饲养的颗粒饲料，微生物群落的多样性和组成在鹿种间没有差异，在过渡前、自然饮食和/或过渡后检测到的微生物群落差异很可能由鹿能够选择特定植物物种和部位时细微的饮食选择差异所驱动。

鹿种的独特系统发育特征与细微饮食差异对微生物群落的影响很可能是混淆的。饮食选择是一种可以通过从母亲或社会群体学习获得的行为，也是一种尽管有早期生活经历仍能保留的遗传控制行为。研究人员在同园实验中控制了习得行为，因此研究中观察到的饮食选择差异很可能反映了研究中无法控制的先天行为。结果表明，即使鹿种间的系统发育差异不直接控制直接影响微生物的消化系统特征，系统发育仍可能通过饮食选择间接影响微生物群落。例如，与白尾鹿相比，骡鹿具有更高的纤维、能量和DMD，在消耗单萜烯-pinene时产生葡萄糖醛酸（PSM解毒的副产品）的速度较慢，并且维持体重和氮平衡所需每日可消化蛋白和可消化能摄入量分别低54%和21%。观察到骡鹿具有相对更高丰度的微生物群组，可能与骡鹿比白尾鹿更低的氮平衡和更高的NDF消化率有关。此外，骡鹿的瘤胃比白尾鹿大，乳头密度比白尾鹿高，这可能鼓励附着在瘤胃上皮层的微生物生长。食草动物选择的饮食可能反映其消化系统系统发育上独特的能力和限制，因此，遗传控制的行为应相对于这些消化能力和营养需求最大化效率。当鹿在起始和结束饮食阶段消耗完全平衡、高质量的饮食时，系统发育的影响可能不如当它们的消化系统受到自然饮食上更困难草料的挑战时那么明显。

从颗粒饲料和天然植物饮食过渡时微生物多样性的变化强调了反刍动物中剧烈饮食变化对微生物的潜在干扰，例如在野生动物康复、易位、重大干扰后的快速再植被、紧急冬季喂养或提供颗粒饲料以控制食草动物对脆弱原生植被或作物的损害时。更好地了解这两种鹿种以及其他共存的反刍动物物种如何利用相同的可用资源，对于预测随着气候变化和人类干扰，野生动物分布重叠增加的后果至关重要。