标签跳跃（Tag Jumping）对基于宏条形码技术的古今环境重建产生重大失真影响

《Environmental DNA》：Tag Jumping Produces Major Distortion on Metabarcoding-Based Reconstructions of Past and Present Environments

本文深入探讨了环境DNA（eDNA）宏条形码（Metabarcoding）分析中标签跳跃（Tag Jumping）现象对物种群落重建的严重影响。研究通过对比双标签（Twin-tagging）和组合标签（Combinatorial tagging）两种实验方案，证实标签跳跃会引入假阳性物种、降低样本间差异度，并扭曲群落时间变化趋势。该发现对古生态学（Paleoecology）和环境监测（Environmental Monitoring）领域具有重要方法论警示意义，建议学界将标签跳跃视为与样本污染同等严重的误差来源。

　　

引言

环境DNA（eDNA）分析通过DNA宏条形码技术已成为环境科学研究的重要手段，能够快速、低成本且非侵入性地重建物种群落。本研究重点审视了宏条形码数据推导的环境重建如何受到标签跳跃过程的影响——即在接头连接过程中，样本特异性标签（tags）被意外改变，导致序列在样本间易位。研究通过比较动物和植物群落重建结果，揭示了标签跳跃对生态解读的潜在扭曲。

材料与方法

研究选取瑞士阿尔卑斯山Grosssee湖的沉积岩芯样本，覆盖从早全新世到近代的沉积层。采用两种标签方案：双标签法（对照组）和组合标签法（受标签跳跃影响）。哺乳动物DNA使用16S线粒体rRNA基因标记，植物DNA使用trnL分子标记。实验在古DNA专用实验室完成，严格遵循防污染protocol，包括使用DNeasy Power Soil试剂盒进行DNA提取，并设置提取空白和PCR阴性对照。

生物信息学分析采用OBITools3流程，包括读段合并、去重复、质量过滤和 taxonomic assignment（97%相似度阈值）。统计分析基于Bray-Curtis相异矩阵，使用PERMANOVA进行组间差异检验，并通过主坐标分析（PCoA）可视化群落差异。

结果

在双标签数据集中，哺乳动物平均检出6.8个属/样本，植物为20.3个属/样本；而组合标签数据集分别增至11.8和34.9个属/样本。标签跳跃导致空白对照中出现大量本应在特定样本中出现的物种读段，表明假阳性污染严重。

PCoA分析显示，双标签数据集的样本间差异显著（哺乳动物14/15组比较显著不同，植物全部15组显著不同），而组合标签数据集显著性大幅降低（哺乳动物仅8/15，植物12/15）。方差分析表明组合标签数据集的总体方差降低200%（哺乳动物）和25%（植物），出现明显的群落均质化效应。

时间趋势分析表明，双标签数据集显示哺乳动物和植物群落具有同步的"驼峰形"变化趋势，而组合标签数据集则出现两者趋势解耦，且早期沉积层中错误出现家养动物（如牛）DNA信号。

讨论

标签跳跃通过异源双链（heteroduplex）形成和T4 DNA聚合酶作用，使序列携带错误标签组合，导致物种被添加到原本不存在的样本中。该过程不仅增加假阳性检出，还降低样本间差异度，并扭曲时间变化趋势。值得注意的是，不同遗传标记（16S vs trnL）受影响程度存在差异，提示序列特性可能影响异源双链形成概率。

对于古生态学研究，标签跳跃可能严重影响物种首次出现（first appearance）和末次出现（last appearance）时间的判定，进而误导对迁移、灭绝和人类活动等重大生态事件的解读。尽管连接法建库具有嵌合体形成率低等优点，但本研究证明其标签跳跃风险足以颠覆整体群落解读结论。

结论

双标签法可有效消除标签跳跃引起的噪声，而组合标签法则会根本性改变eDNA推断的动植物群落结构。标签跳跃不仅引入假阳性物种，还增加样本内方差，降低统计显著性。研究强调需在所有宏条形码研究中认识到标签跳跃的严重性，并改进方法学描述规范。

作者贡献与致谢

S.R.-M.、M.A.M.和J.K.共同设计研究；S.R.-M.、M.A.M.和D.Y.-T.H.完成数据获取与分析；论文由S.R.-M.、M.A.M.和J.K.共同撰写。研究受瑞典研究理事会（Dnr 2017-04548）和瑞士国家科学基金会（P2BEP2-188256）资助。作者声明无利益冲突。