基于稳定同位素示踪技术评估临时河流水生大型无脊椎动物空中扩散模式及其生态意义

《Freshwater Biology》：Where Do You Fly From? Assessing Aerial Dispersal in Temporary Rivers Using Stable Isotopes

本文创新性地运用15N稳定同位素标记技术，首次在临时河流（TRs）生态系统中系统评估了水生大型无脊椎动物在干旱期的空中扩散机制。研究通过在中游断流池（DPs）施加同位素标记物，并结合中宇宙实验，证实了DPs作为生态避难所对维持区域生物多样性和促进群落恢复的关键作用。文章揭示了不同生物类群（水生昆虫成虫、幼虫和水生专性生物）的扩散规律，发现了包括虫媒传播（zoochory）在内的多种被动扩散途径，为干旱化背景下河流生态系统的保护管理提供了重要科学依据。

　　

ABSTRACT

扩散是确保生态系统内基因流动和物种交换的关键生态过程。在临时河流（TRs）中，扩散是群落构建的关键驱动因素，因为它决定了生物体适应季节性干旱并维持稳定种群的能力。特别是，临时河流中的断流池（DPs）在干旱期充当重要的生态避难所，保护地方和区域生物多样性，并作为水生大型无脊椎动物空中扩散的源。水生大型无脊椎动物的性状常被用作估计扩散的代理指标。然而，在临时河流中测量水生大型无脊椎动物实际扩散的研究非常有限。

本研究通过在同位素上富集断流池，并利用中宇宙实验评估扩散，调查了在非流动阶段存有断流池的临时河流中大型无脊椎动物的扩散。我们的最终目的是评估水生大型无脊椎动物在存有断流池的临时河流中进行空中扩散的能力。实验在西班牙东北部地中海气候源头临时河流溪流中进行，该溪流以夏季间歇性水流为特征。我们使用了八个未定殖的中宇宙实验装置，沿干涸的河床安装在断流池的上游和下游。使用标记的氯化铵（¹⁵NH₄Cl）作为同位素示踪剂来标记断流池并追踪大型无脊椎动物的扩散。

我们首先评估了¹⁵N同位素示踪剂在追踪水生大型无脊椎动物空中扩散方面的有效性。然后，我们检查了断流池上游和下游的扩散距离，预测中宇宙实验装置与断流池之间的群落相似性将随着地理距离的增加而降低，突显空间邻近性在塑造群落结构中的关键作用。

同位素富集在断流池中随时间增加，富集个体的比例随生命周期阶段（如幼虫或成虫）而变化。富集的四节蜉（Cloeon sp.）和摇蚊亚科（Chironomini）幼虫是在断流池和中宇宙实验装置中捕获的最丰富的类群。富集的水生专性类群（如软体动物、水螨）也出现在中宇宙实验装置中。从断流池向上游和下游，富集的同位素样本逐渐减少。群落相似性分析揭示了断流池与中宇宙实验装置之间的显著差异，而上游和下游河段则聚集在一起。此外，观察到环境和地理距离与群落组成之间存在微弱的正相关关系。

我们的研究结果通过使用同位素富集技术，有助于理解水生大型无脊椎动物的扩散机制，开创了该技术在临时河流中的应用，并成功检测到了后续世代中的同位素标记。我们强调在临时河流网络中维持断流池的重要性，以容纳定殖者，这些定殖者将通过水生昆虫成虫的主动空中扩散或通过虫媒传播的被动空中扩散，在干旱期间和之后促进群落恢复。考虑到未来的干旱情景，应优先考虑将断流池作为避难所进行保护（和潜在促进），以避免临时河流中地方和区域生物多样性的丧失。

1 Introduction

扩散是指生物在不同栖息地斑块之间的移动。它是确保地方种群间基因流动（即集合种群）、地方群落间物种交换（即集合群落）以及生态系统内物质和能量流动（即集合生态系统）的关键生态过程。扩散由取决于生物体扩散能力的内在因素（如飞行能力）和外在因素（如风、地理障碍或栖息地破碎化）共同驱动。每种生物都有不同的扩散模式，这些模式可能因其生命周期和发育阶段而异。在淡水生态系统中，许多水生大型无脊椎动物仅在成虫阶段离开水体，其成虫阶段可能是严格水生的（如软体动物或甲壳动物）、完全陆生的（如蜉蝣目或双翅目）或栖息于水陆两种环境（如异翅目或鞘翅目）。

临时河流（TRs）是在时间或空间上某一点停止流动或完全干涸的河流生态系统。它们经历着流动水（流水条件）、断流池（静水条件）和陆地栖息地（干涸河床）之间的动态转变。临时河流是地球上最常见的河流类型，由于气候变化和用水需求增加，它们在许多地区正变得越来越频繁。临时河流中的大型无脊椎动物群落经历着反复的定殖和灭绝过程，因此理解临时河流中的扩散过程对于生物多样性保护和确保这些生态系统对全球变化的韧性至关重要。在此背景下，断流池（DPs）作为生态过渡栖息地，在干旱期扮演着避难所的重要角色，维持水生生命并帮助保护地方和区域生物多样性。诸如水池持久性、大小、捕食压力、理化条件以及与河流水流断开后的时间等因素显著影响其生态功能。尽管断流池很重要，但对其关注有限，这凸显了需要进行全面研究以指导有效的保护和管理的策略。

临时河流中的扩散在非流动阶段之前和之后尤其相关。在非流动阶段之前，无法产生抵抗策略以在当地生存的大型无脊椎动物需要找到水生避难所来完成其生命周期。在非流动阶段之后，这些避难所被认为在很大程度上有助于水流重新连接期间的群落恢复（即韧性）。应对干燥或从中恢复的扩散机制多种多样。一些类群产生耐干燥的休眠阶段或保持滞育状态，在非流动阶段后重新激活其生理活动。这些抵抗策略也被称为时间上的扩散，在临时河流中可能非常重要。相反，许多类群采用诸如在断流池或上游或下游的常年河段寻求庇护的机制，它们将从那里在非流动阶段之后进行扩散。这些弹性策略也被称为空间上的扩散，依赖于生物体的扩散能力、景观配置和避难所的存在。漂流是常年河流中常见的扩散过程，在临时河流中被认为是一种韧性途径，促进生物体通过水生栖息地移动。或者，通过空中成虫阶段的扩散成为临时河流中大型无脊椎动物扩散的一种关键且广泛的方式，使生物体能够飞越陆地寻找散布在景观中的避难所。

尽管扩散具有生态相关性，并且水生大型无脊椎动物存在广泛的扩散策略，但直接测量扩散仍然很少见，扩散能力通常是根据文献中的性状推断的。物理标记-重捕方法对这些目的很有用。然而，这些方法都是基于个体的，当目的是获得整个种群或群落的扩散概况时，无论其大小如何，都显得不切实际。

稳定同位素（如¹⁵N）已广泛用于淡水系统研究食物网、营养相互作用和饮食组成。然而，它们也可用于追踪扩散，同时避免其他技术的缺点，例如其侵入性可能改变所研究动物的行为模式。例如，使用¹⁵N富集来标记大量溪流大型无vertebrates，直接测试了两种石蝇种群在源头溪流之间的成虫扩散。这些和其他研究主要集中在食草动物物种，因为它们直接以藻类为食，藻类最初吸收¹⁵N，然后通过营养链转移。然而，最近证明在溪流中对多个群落分类群和各种摄食类型（如滤食者和捕食者）进行稳定同位素标记是可行的。尽管有这些进展，使用稳定同位素评估水生大型无脊椎动物扩散仍处于发展阶段。河流中的标记技术主要在流水条件下进行测试，通常只关注单一物种，而不是跨多个分类群。此外，我们对大型无脊椎动物个体扩散距离的理解仍然有限，并且迄今为止还没有研究解决通过产卵和在新栖息地定殖对后续世代的标记问题。

在本研究中，我们调查了存有断流池的临时河流中水生大型无脊椎动物的空中扩散能力。我们假设断流池作为避难所，在非流动阶段容纳大型无脊椎动物，并可能在非流动阶段后对群落恢复做出贡献。因此，我们设计了一个使用中宇宙实验装置的野外实验，以排除临时河流中其他潜在的时间和空间扩散途径，例如利用潜流带、耐干燥休眠阶段、漂流和游泳。八个未定殖的中宇宙实验装置被放置在干涸河床上，距离五个同位素富集的断流池的上游和下游距离递增。这种设置使我们能够测试来自断流池的空中扩散是否有助于大型无脊椎动物对孤立栖息地的定殖。我们的第一个目标是测试同位素示踪剂（¹⁵N）在追踪不同生命阶段和随时间推移的大型无脊椎动物扩散方面的效率。对于此目标，我们假设暴露于富集断流池的大型无脊椎动物的同位素标记浓度会随时间增加，对于具有空中成虫阶段的类群（如蜉蝣目和双翅目）达到最大值所需的时间比对于具有水陆两栖（半水生）成虫阶段的物种（如半翅目和鞘翅目）要长。我们还假设从断流池出现的富集空中成虫的比例低于其相应的幼虫，因为氮是在幼虫阶段获取的，并且当其身体从一个阶段变为另一个阶段时，同位素信号被稀释。因此，中宇宙实验装置中的富集幼虫应具有较低的同位素信号，但这仍表明有雌虫从富集断流池飞来、产卵并孵出幼虫。因此，我们预计水生专性生物（如软体动物和水螨）不会出现同位素富集。我们还假设富集个体的比例将随着距离我们富集断流池的增加而减少，因为距离通过定殖和灭绝动态影响断流池的多样性。我们的第二个目标是评估断流池和中宇宙实验装置在群落结构方面的差异，以评估这些断流池如何作为定殖者的源做出贡献。对于第二个目标，我们假设断流池和中宇宙实验装置的群落会随时间变得更加相似，并且它们的相似性与它们之间的距离呈负相关。通过使用未定殖的中宇宙实验装置，我们限制了其他类型的群落恢复途径（无论是通过抵抗还是韧性策略）。此外，我们预计断流池与中宇宙实验装置之间的距离对于构建水生大型无脊椎动物群落而言，比它们环境条件的差异更为重要。这是由于中宇宙实验装置之间的理化条件相似、实验持续时间短以及研究区域规模小。

2 Methods

2.1 Study Area and Experimental Set-Up

实验在夏末于西班牙东北部自然区域（Sant Lloren? del Munt i l'Obac自然公园）的Vall d'Horta临时河流进行。该地区具有典型的地中海气候，夏季炎热干燥。该溪流表现出典型的池-滩形态，基岩比例高，允许形成在夏季可能持续存在的断流池，从而充当避难所。该溪流分为一个具有断流池的上游临时段（实验在非流动阶段在此进行）和一个下游常年段。在一个25米长的河段内确定了五个连续且非常接近的断流池。这些断流池深度从8厘米到146厘米不等，宽度从70厘米到410厘米不等，长度从110厘米到530厘米不等。在同一溪流河段，沿干涸河床安装了八个未定殖的150升中宇宙实验装置。四个中宇宙实验装置位于最上游断流池上游50米、120米、228米和398米处，另外四个中宇宙实验装置放置在最低断流池下游50米、94米、504米和564米处。中宇宙实验装置M7和M8的位置也分别位于常年河段末端上游96米和36米处。常年溪流河段位于断流池下游600米处。中宇宙实验装置的冠层覆盖率从29%到93%不等，平均为54%。为避免随水引入大型无脊椎动物繁殖体（卵或小幼虫），中宇宙实验装置使用成分与研究区域相似的市售瓶装矿泉水填充。此外，每个中宇宙实验装置内放置了四块在漂白剂中灭菌24小时的无菌石头，为大型无脊椎动物提供合适的栖息地和潜在避难所，并促进藻类定殖。在每个中宇宙实验装置旁边设置了一个飞行拦截陷阱，以捕捉向上游或下游飞行的昆虫。此外，在断流池和中宇宙实验装置周围区域，每次预定采样时间都进行了手网采样，以收集飞行个体。手网采样收集的个体数据未包含在水生群落（如断流池和中宇宙实验装置）的分析中，而是专门用于评估这些个体相对于同位素富集的空间分布。

2.2 Timing, Sampling and Environmental Data

实验于2021年9月6日开始，此时中宇宙实验装置已注水，并将同位素示踪剂（¹⁵NH₄Cl）添加到断流池中。使用250微米网孔的手网通过踢动法从断流池收集了添加前的大型无脊椎动物样本（即对照样本）。此外，从在₀之前4天设置的 emergence traps 中获得了添加前样本。在9月13日、22日和29日每周收集一次 emergence traps 和 flight interception traps 的样本。实验于2021年10月4日结束，此时从 emergence traps 和 flight interception traps 收集了样本。此外，对中宇宙实验装置（在_f单次采样）和断流池（在₀和_f采样两次）进行了大型无脊椎动物采样。在断流池中，采样通过按比例覆盖所有可用微栖息地同时保持跨站点一致的采样努力来标准化。在中宇宙实验装置中，整个水内容物通过手网排出，以确保全面收集大型无脊椎动物。将大型无脊椎动物保存在96%乙醇中，并在冷藏条件下储存，直至完成鉴定和同位素分析。所有大型无脊椎动物都使用双目立体镜鉴定并计数到最低可能的分类分辨率（种、属或科水平）。

在每次大型无脊椎动物样本收集的同时，每周在每个断流池和中宇宙实验装置中测量一次非生物变量。使用多参数探头测量氧饱和度、水温、pH和比电导率。还使用数据记录器连续测量每个采样点的水温。此外，使用球形密度计测量每个断流池和中宇宙实验装置的冠层覆盖率。通过将最终采样期间收集的材料（主要是树叶）在60°C的烘箱中干燥48小时，确定了实验期间在中宇宙实验装置中积累的有机物的干重。

2.3 Experimental ¹⁵N Enrichment and Isotopic Analysis

使用¹⁵N作为同位素示踪剂来富集断流池。在₀时向断流池添加了10克氯化铵（¹⁵NH₄Cl），在₂时添加了5克，以标记生活在那里的无脊椎动物用作食物的自养和碎屑资源。为确保均匀分布，将¹⁵NH₄Cl用水溶解，并使用喷壶均匀分散到整个断流池中。使用添加前样本来调整¹⁵N阈值，并确定添加后样本是否被标记。

对于同位素分析，从断流池、中宇宙实验装置、飞行拦截陷阱和 emergence traps 中总共选择了275个大型无脊椎动物的同位素样本。其中43个是作为对照的添加前同位素样本，232个是添加后同位素样本。每个同位素样本对应于每个采样日期和每个站点（断流池或中宇宙实验装置）的单个分类群。对于某些具有相似扩散能力的分类群，例如蜗牛和小型动物（如桡足类和介形类），如果从同一站点和日期收集，则将其合并。这是必要的，因为像桡足类和介形类这样的分类群非常小，它们的生物量达不到同位素分析所需的最低阈值（约0.2毫克）。此外，由于它们相似的扩散能力，将这些分类群分组。对于小型分类群（如摇蚊科、四节蜉属），从每个同位素样本中选择多个个体。对于中型分类群（如Stictonectes, Agabus, Hydraena），选择数量从一个到几个不等，取决于样本的丰度。最后，对于大型分类群（如碧伟蜓、绿综蟌），使用一块组织（通常是腹部）进行同位素分析。然后通过蒸发去除酒精，并在60°C下干燥6小时，然后在-55°C和0.05毫巴下冷冻干燥2天。通过EA-IRMS技术对封装好的同位素样本进行N（占总干质量的百分比）和¹⁵N同位素信号分析。

2.4 Biological Categories

根据其生命周期、发育阶段以及 consequently 其扩散能力，将大型无脊椎动物分为四个非重叠组：半水生成虫、空中成虫、水生幼虫和水生专性生物。半水生成虫被定义为其成虫阶段完全或主要在水中（包括其表面）发育的大型无脊椎动物，例如甲虫（如龙虱科、豉甲科）或仰泳蝽（如仰泳蝽科、划蝽科）的成虫阶段。空中成虫被定义为其成虫阶段主要发生在水外，栖息于陆地或空中环境的大型无脊椎动物，例如摇蚊、蚊子或蜉蝣的成虫阶段。水生幼虫组包括所有在幼虫阶段严格水生但成虫阶段完全或部分为空中的所有大型无脊椎动物，涵盖了前两个类别的所有幼虫阶段。最后，水生专性生物被包括在那些 obligatorily 完成其整个生命周期在水中并且自身无法进行空中扩散的大型无脊椎动物组中，例如蜗牛、小型动物（如桡足类和介形类）和水螨。

2.5 Data Analysis

为检验H1（即大型无脊椎动物中的同位素浓度会随时间增加，取决于生物类群），分析了暴露于富集断流池的大型无脊椎动物组织中¹⁵N掺入的时间变化[log(δ¹⁵N)]。此分析针对在 emergence traps 中采样的两个生物类群进行：半水生成虫和空中成虫。对于每个组，拟合了线性、指数、二次和三次多项式模型，以评估时间与δ¹⁵N值之间的关系。使用决定系数（R²）和每个模型的Akaike信息准则（AIC）评估拟合优度。

针对H2（旨在比较断流池和中宇宙实验装置中幼虫和成虫的同位素富集），使用添加前同位素样本来建立评估同位素标记的δ^{15N阈值。采用了基于Enss等人方法但更保守的方法，使用最大氮值而不是平均值。计算涉及将两倍标准差加到最大15N值。高于阈值的值被视为“富集”，低于阈值的值被视为“未富集”。}

为检验H3（即预测同位素富集样本的比例随距离变化），使用来自中宇宙实验装置、飞行拦截陷阱和断流池踢动采样后的179个同位素样本，描述了沿距离梯度的富集和未富集同位素样本的相对比例。使用带有连续性校正的双样本比例相等性检验来比较上游和下游中宇宙实验装置之间富集样本的比例。此外，使用Spearman等级相关检验评估了中宇宙实验装置中富集样本比例与冠层覆盖率之间的关系。

为检验H4（解决跨溪流位置和栖息地的大型无脊椎动物群落组成差异），首先使用log-转换对丰度数据进行转换。随后，使用R中vegan包基于Bray-Curtis距离进行非度量多维标度（NMDS）分析。使用'vegan'包中的'adonis2'函数进行置换多元方差分析（PERMANOVA），基于Bray-Curtis相异度，使用999次排列来确定因素的显著性。枝角类、桡足类和介形类未包含在此分析中。

最后，为检验H5（检查环境和地理距离驱动因素对群落组成的作用），计算了跨采样时期的非生物变量（pH、%DO、T和SPC）的平均值，并使用'scale'函数标准化。随后，使用R中vegan包中的'vegdist'函数计算欧几里得距离。使用'scale'函数标准化配对的溪流距离（以米为单位）。使用丰度数据，通过'vegan'包中的'mantel'函数进行Mantel检验，分析群落相异性（基于Bray-Curtis距离的beta多样性）与地理距离和环境因素之间的关系。

3 Results

实验期间，共收集到38,538个个体，代表103个分类群。其中，通过踢动采样收集了33,675个个体，断流池有13,633个，中宇宙实验装置有20,042个。从断流池鉴定出76个分类群，从中宇宙实验装置鉴定出29个分类群。四节蜉（Cloeon sp.）和摇蚊亚科（Chironomini）是断流池（相对丰度分别为0.37和0.14）和中宇宙实验装置（相对丰度分别为0.56和0.27）中最丰富的类群。其他四个分类群在断流池和中宇宙实验装置的所有样本中都存在（库蚊属、水螨科、Hydraena sp.和Pentaneurini）。共有10个分类群在断流池的两个采样时间持续存在，但仅在一些中宇宙实验装置中发现（伊蚊属、河螺、幽蚊属、Graptodytes sp.、Gyrinus sp.、Macropelopinii、Notonecta maculata、Oulimnius sp.、Oxycera sp.和Stictonectes sp.）。每个样本的分类丰富度在断流池中从36到47不等，在中宇宙实验装置中从9到18不等。

从 emergence traps 和 flight interception traps 中鉴定出4863个个体，代表属于19个科的36个分类群。在飞行拦截陷阱中，虽然四节蜉（Cloeon dipterum）是第二丰富的分类群（相对丰度0.24），但甲虫作为一个类群是最丰富的，Hydraena sp.、Anacaena sp.和Dryops sp.合计相对丰度为0.51（分别为0.30、0.12和0.09）。在两个侧向飞行拦截陷阱中未发现水生大型无脊椎动物。emergence traps 中最丰富的分类群是摇蚊亚科，其次是四节蜉（Cloeon simile）和四节蜉（C. dipterum）（相对丰度分别为0.46、0.12和0.09）。在 emergence traps 中，发现有409只水螨幼虫附着在成年摇蚊上，7只附着在成年蚊子上。不同时间样本中，emergence traps 的分类丰富度从7到18不等，而飞行拦截陷阱的分类丰富度从0到5不等。断流池和中宇宙实验装置的踢动样本捕获的分类群数量最多，其次是 emergence traps 和飞行拦截陷阱。此外，使用手网采样了五只成年飞行个体：一只碧伟蜓、赤蜻和三只绿综蟌。

正如H1所预测的，¹⁵N富集随时间在不同生物类群间变化。对于空中成虫，三次多项式模型拟合最佳（R² = 0.85, AIC = 164, p < 0.001），而对于半水生成虫，线性模型最合适（R² = 0.49, AIC = 64, p = 0.001）。半水生成虫（如甲虫）的¹⁵N水平上升较早；然而，从第二周开始，空中成虫（如蜉蝣目和双翅目）显示出更高的¹⁵N含量。

在使用所有采样方法（即踢动法、emergence traps、flight interception 和手网）获得的同位素样本中，以及在不同的物候阶段和世代中，包括未成熟阶段（若虫或幼虫）、成虫和下一代的未成熟阶段，都发现了富集个体。正如H2所预期，在¹⁵N添加后收集的232个同位素样本中，总共有123个（53%）被富集。断流池中富集同位素样本的比例（81% ± 0.08%）高于中宇宙实验装置（36% ± 0.1%）。在中宇宙实验装置中，空中成虫（通过飞行拦截陷阱捕获）的标记比例最低（9%），其次是半水生成虫（39%）。在中宇宙实验装置中也检测到某些类群的富集幼虫（54%），推测是那些生活在富集断流池中的个体的下一代，例如摇蚊科、蚊科和四节蜉属。出乎意料的是，在水生专性类群（56%）中也观察到了富集，包括蜗牛（如波塔摩螺、水螨和小型动物（桡足类和介形类））。

在¹⁵N添加后收集的179个踢动和飞行拦截同位素样本中，所有来自断流池的同位素样本都是富集的。正如H3所预测的（即同位素富集随距离断流池的增加而下降），最靠近断流池的中宇宙实验装置（M1和M5）具有最高比例的富集同位素样本（分别为71%和78%）。此外，富集同位素样本的相对比例呈现出阶梯式模式，在天然断流池（源）的下游和上游显示出类似的减少。然而，上游（45.71%）和下游（33.33%）中宇宙实验装置之间富集样本比例的差异无统计学意义（p = 0.156）。尽管如此，即使在最远的中宇宙实验装置中也发现了蜉蝣目和鞘翅目的富集同位素样本。在位于上游398米处的M4，Caenis sp.和Graptodytes sp.被富集，而在研究溪流的另一端，位于富集天然池下游564米处，只有Hydraena sp.被富集。

观察到鞘翅目有类似的阶梯式模式。对于双翅目和水生专性生物（蜗牛、水螨、桡足类和介形类），在上游和下游区域观察到更随机的分布，而蜉蝣目显示出对上游定殖的偏好。

未发现富集样本比例与冠层覆盖率之间存在显著关系（Spearman's ρ = 0.02）。与H4一致，NMDS分析显示天然池（断流池和常年河段）内在₀和_f群落之间的群落组成没有分化。NMDS分析的压力值为0.06。PERMANOVA分析确定了栖息地（中宇宙实验装置和天然池）之间（R² = 0.45, F = 8.47, p = 0.003）和溪流位置（上游、下游和源）之间（R² = 0.56, F = 5.91, p = 0.001）群落组成的显著差异。

关于H5，Mantel检验表明Bray-Curtis群落相异性与环境距离（Mantel statistic r = 0.37; p = 0.07）和地理距离（Mantel statistic r = 0.24; p = 0.06）