斑马鱼幼虫细胞外囊泡体内研究新突破：细胞特异性标记与高纯度分离技术方案

《Cell Communication and Signaling》：Enabling mechanistic studies of EVs in vivo: a protocol for isolation and cell-specific labelling in larval zebrafish

本研究针对斑马鱼幼虫模型中细胞外囊泡(EV)研究缺乏可靠分离和细胞特异性标记工具的难题，开发了基于地衣芽孢杆菌蛋白酶的组织消化与尺寸排阻色谱(SEC)相结合的高纯度EV分离方案，并构建了UAS:CD63-GFP转基因系统实现径向胶质祖细胞的特异性EV标记。该方案显著提高了细胞存活率(达95.7%)，经GW4869处理验证可灵敏检测EV释放的剂量依赖性抑制(20μM处理减少45.7%)，为体内EV功能机制研究提供了重要技术平台。

　　

在细胞生物学研究领域，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)作为细胞间通讯的关键介质，近年来受到广泛关注。这些直径30-150纳米的膜性小泡携带蛋白质、脂质、RNA和DNA等生物活性分子，在免疫应答、癌症进展和神经退行性疾病等生理病理过程中发挥重要作用。尽管EVs具有巨大的临床应用潜力，包括作为液体活检的生物标志物和靶向药物递送载体，但对其体内功能的深入理解仍面临重大挑战。

目前EV研究领域存在三个主要技术瓶颈：首先，传统EV分离方法如超速离心(UC)和密度梯度超速离心(DGUC)可能损害EV的生物功能活性；其次，常用的组织消化酶(如胶原酶)会显著影响细胞存活率，导致细胞膜破裂释放细胞内EV，干扰分泌型EV的准确定量；最后，缺乏可靠的细胞特异性EV标记工具，难以在完整生物体内追踪特定细胞来源的EVs的命运和功能。

为了解决这些难题，Kiyga等研究人员在《Cell Communication and Signaling》上发表了题为"Enabling mechanistic studies of EVs in vivo: a protocol for isolation and cell-specific labelling in larval zebrafish"的研究论文。他们以斑马鱼幼虫为模型，开发了一套优化的EV分离和细胞特异性标记方案，为体内EV功能机制研究提供了强有力的技术平台。

关键技术方法包括：使用地衣芽孢杆菌蛋白酶进行组织消化，通过尺寸排阻色谱(SEC)分离EVs，利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)进行EV表征，采用GW4869抑制EV生物合成验证方案灵敏度，并构建UAS:CD63-GFP转基因系统实现径向胶质祖细胞的特异性EV标记。研究样本来源于4天受精后(dpf)的斑马鱼幼虫头部组织。

Bacillus Licheniformis蛋白酶组织消化获得最佳细胞存活率

研究人员系统比较了三种组织消化方法：胶原酶I型处理、机械匀浆法和地衣芽孢杆菌蛋白酶酶消化法。通过流式细胞术分析显示，胶原酶处理组细胞存活率仅为64.4%±1.6%，机械匀浆法为88%±0.5%，而地衣芽孢杆菌蛋白酶处理组达到最优的95.7%±1.3%。这一结果表明地衣芽孢杆菌蛋白酶对细胞完整性的影响最小，适合用于后续EV分离研究。

EVs的分离与表征

研究团队测试了四种样品制备策略：2000g、10000g、2000g+UF(10kDa)和10000g+UF(10kDa)。NTA和BCA分析表明，2000g+UF和10000g+UF策略在早期馏分(F1-F4)中产生EV富集、蛋白低含量的样品。进一步通过TEM分析发现，10000g+UF组分的污染更少，EV纯度更高，因此被确定为最佳分离方案。

优化后的方案确定使用2.1mL洗脱缓冲液体积，从50个幼虫头部中可获得最佳EV产量。透射电镜确认分离的EVs直径小于200纳米，且纯度良好。

GW4869抑制斑马鱼幼虫大脑中的EV释放

为验证方案的灵敏度，研究人员用GW4869(一种已知的EV生物发生抑制剂)处理斑马鱼幼虫。结果显示，10μM GW4869处理使EVs减少23.7%±9.8%，而20μM处理则显著抑制EVs达45.7%±7.8%，证明该方案能灵敏检测EV释放的变化。

细胞特异性标记和斑马鱼幼虫大脑中EVs的体内成像

研究团队构建了UAS:CD63-GFP系统，结合径向胶质细胞特异性Gal4驱动系，实现了特定细胞类型EVs的特异性标记。通过瞬时转染和稳定转基因系两种策略，成功在活体组织中标记了径向胶质祖细胞及其癌前对应细胞释放的EVs。

超分辨率时间推移成像揭示了三种不同的EV群体：CD63-GFP+、mCherry+和CD63-GFP+/mCherry+，可能代表不同来源的囊泡群体。

径向胶质祖细胞释放的EVs的检测与表征

从Zic:CD63-GFP幼虫中分离的EVs经NTA和Western blot分析证实，能够从总EV群体中检测到细胞特异性标记的EVs，约占总EV量的1-2%，证明了该方案在复杂生物样品中检测特定细胞来源EVs的灵敏度。

本研究建立的斑马鱼幼虫EV分离和标记方案具有重要创新价值。地衣芽孢杆菌蛋白酶消化结合SEC的方法不仅保持了细胞完整性，还提高了EV分离的纯度和产量，克服了传统胶原酶消化导致细胞存活率低的问题。GW4869剂量依赖性抑制实验证明了该方案在检测EV释放变化方面具有高灵敏度。

特别值得注意的是，UAS:CD63-GFP系统与细胞特异性Gal4驱动系的结合，为在完整生物体内研究特定细胞类型EV的生物学功能提供了强大工具。斑马鱼模型具有与人类相似的免疫系统特征，加上胚胎透明便于实时成像的优势，使其成为研究EV在生理和病理条件下功能的理想平台。

该研究方案的建立将推动EV研究从描述性观察向机制性研究的转变，允许研究人员通过遗传和药理学手段干预EV生物发生和释放，并定量评估这些干预措施的效果。随着斑马鱼和果蝇等模型中多种细胞类型特异性Gal4驱动系的广泛应用，这一技术平台有望在发育生物学、神经科学和癌症研究等领域发挥重要作用，深化我们对EV介导的细胞间通讯机制的理解。