洪水驱动的微生物复苏：孟加拉国洪后农业与居住土壤中的功能转变与有益类群

《MicrobiologyOpen》：Flood-Driven Microbial Resurgence: Functional Shifts and Beneficial Taxa in Post-Flood Agricultural and Residential Soils in Bangladesh

本研究探讨了2024年孟加拉国洪水对土壤微生物群落的影响，揭示了洪水通过促进有益微生物（如固氮菌和溶磷菌）的扩散，增强土壤养分循环（如氮、磷、硫循环）和生态系统恢复力。研究采用全长16S rRNA测序（ONT平台），发现洪水增加了微生物多样性，并引入了29种功能有益类群，为洪水易发区的土壤健康管理和农业可持续性提供了新见解。

　　

引言

洪水作为一种自然干扰事件，显著改变土壤生态系统，重塑微生物群落并形成由不断变化的理化条件所塑造的新生态位。尽管洪水常与破坏和损害相关，但它也能对土壤微生物组产生有益影响，增强微生物多样性、养分循环和生态系统功能。在孟加拉国，洪水与土壤肥力之间的联系深深植根于该国的农业传统。几个世纪以来，农民依赖季节性洪水补充土壤养分，特别是在三角洲地区，河流洪水带来的泥沙沉积用有机质和重要矿物质丰富了土壤。孟加拉国位于世界上最大的三角洲，由于其广泛的河流网络、低洼地形和热带季风气候，极易发生洪水。2024年8月，孟加拉国经历了近期最严重的洪水事件之一，尤其影响了东部地区，包括Feni、Noakhali、Lakshmipur和Comilla。本研究聚焦于Feni区的Chhagalnaiya subdistrict，利用牛津纳米孔平台的全长16S rRNA测序，表征了洪水和非洪水地区农业及居住土壤中的微生物多样性。研究假设洪水能够富集具有功能多样性的类群，增强养分循环和生态系统恢复。

方法

样品采集与制备

研究于2024年9月在Feni的Chhagalnaiya附近区域采集了8份土壤样品（深度15厘米）。样本量基于配对比较研究设计，侧重于可行性和洪水事件后的物流限制。采样点包括3个洪水影响的居住区土壤样本、3个洪水影响的农业土壤样本、1个非洪水居住对照样本和1个非洪水农业对照样本。所有样品使用无菌不锈钢土钻采集，置于密封无菌Whirl-Pak?袋中，冰上保存并运输，6小时内转移至-20°C冰箱保存直至DNA提取。

DNA提取

使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen, 47014）从所有土壤样品中提取DNA。500毫克土壤按照制造商协议处理。提取DNA的纯度和浓度分别使用Nanodrop分光光度计和Qubit 4.0荧光计评估，高质量DNA的260/280比率约为1.8，260/230比率约为2.0。

文库制备

使用16S Barcoding Kit 24 V14（SQK-16S114.24）进行文库制备。基因组DNA样品用无核酸酶水稀释10 ng DNA至终体积15 μL。使用LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix制备PCR混合物，并添加条形码用于样品识别。在特定循环条件下进行扩增，随后添加EDTA停止反应。将条形码样品按等摩尔比例混合，使用AMPure XP Beads纯化并定量。将稀释的快速适配器混合物添加到条形码DNA中，制备好的文库使用MinION平台进行测序。

生物信息学工作流程

使用牛津纳米孔技术生成全长16S rRNA扩增子。随后的微生物组生物信息学分析使用QIIME 2版本2020.8.0进行。将原始单端序列数据导入QIIME 2并处理为QIIME工件。使用q2-vsearch插件进行去重复、嵌合体去除和聚类。去重复将相同序列合并为独特特征，生成特征表和代表性序列。通过比对SILVA 138参考数据库识别和过滤嵌合序列。然后对非嵌合序列进行开放参考聚类，使用相同数据库，以85%序列相似性阈值将特征聚类为操作分类单元。使用RESCRIPt基于Silva 138 SSURef NR99全长序列训练朴素贝叶斯分类器。使用该分类器通过q2-feature-classifier插件为非嵌合序列分配分类学。最后，使用q2-metadata插件的表格化方法生成交互式可视化结果以详细探索结果。

统计分析

使用自定义Python脚本将生物信息学工作流程结束时生成的分类学表转换为Phyloseq对象。随后的统计分析使用自定义R脚本利用microeco包进行。为评估洪水和非洪水环境中微生物群落的多样性和组成，进行了α和β多样性分析。使用Chao1多样性指数评估α多样性，提供各样本组内物种丰富度的见解。使用Bray-Curtis相异性分析β多样性，比较组内和组间样本。此外，基于Bray-Curtis相异性进行主坐标分析以可视化群落差异。最后，对α和β多样性结果应用Wilcoxon秩和检验以评估统计显著性。鉴于样本量有限，不足以达到统计功效，统计分析本质上是探索性的而非验证性的。

土壤有益微生物筛选

通过排除居住和农业对照样品中的微生物，分离出洪水后引入农业和居住土壤的微生物，专注于洪水后的引入。将精炼列表与已建立的数据库和同行评审文献进行交叉引用，以确认其作为有益土壤微生物的作用。系统分配功能类别和土壤位置，确保与经过验证的参考文献一致。删除重复和角色模糊的微生物以保持清晰度和准确性。

病原体筛选

为识别和过滤潜在人类致病物种，对所得分类学谱进行了致病性筛选过程。首先从NCBI病原体数据库下载已知病原体的综合列表。然后将该列表与宏基因组学分析获得的分类学分类进行交叉引用。通过比较两个数据集，可以识别土壤样品中存在的已知病原体。

质量保证

为确认本研究中土壤样品的正确采集和处理，通过比较这些样品的分类学谱与外部项目的分类学谱实施了质量保证步骤。外部项目在Khulna进行，涉及好氧和厌氧土壤样品。从该数据集中随机选择8个好氧土壤样品进行比较，因为它们的环境条件更接近本研究中的样品。外部项目与采样点地理接近表明核心微生物类群存在合理重叠，有助于验证洪水土壤数据集的生物学合理性。同时，由于土壤条件和区域差异，两个项目之间分类学组成的差异也在预期之中。通过检查重叠和分歧，该比较作为关键检查点以确保观察到的微生物群落反映真实环境条件。

为进一步评估生物信息学流程的准确性，对相同样品使用修改后的方法重复分析。在原始流程中，应用了基于参考的嵌合体去除和聚类，利用Silva 138数据库最小化伪影。在修改版本中，对这些步骤替换为从头方法，仅基于数据集内关系实现嵌合体检测和OTU聚类。然后比较两种流程生成的分类学谱。方法间主要类群的高度一致性表明流程的稳健性，而差异可能是由于测序错误或新嵌合体保留导致的从头方法中稀有类群膨胀所致。这种双分析框架有助于识别系统偏差并确保下游生态解释不受方法学选择的影响。

结果

微生物丰度和组成

条形图揭示了每个样品的微生物丰度，图例表显示了检测到的前15个最丰富物种。Woesearchaeales目（Nanoarchaeia纲）的古菌是微生物群落中最丰富的成员，存在于所有样本组中。来自Gemmataceae科的细菌以及Candidatus Omnitrophus和Haliangium属也一致在所有组中检测到。此外，来自SAR324（海洋B组）进化枝和vadinHA49纲的细菌在所有组中发现，尽管丰度较低。这些类群合计占每个样品组成的近50%。值得注意的是，前15个最丰富物种都无法分类到种级，表明分类学分辨率存在局限性。

农业和居住样品之间的差异

比较分析揭示了微生物群落中不同的栖息地偏好。大多数最丰富的类群（前15个中的13个）在农业土地样品中比居住样品中更普遍。例外是Woesearchaeales古菌和Haliangium细菌，它们在两种环境中同样丰富。这种分歧通过每个栖息地中独特类群的存在得到进一步强调：来自Moraxellaceae科和Candidatus Solibacter属的细菌仅在土地样品中检测到，而包括Lysobacter sediminicola、Ahniella affigens和Microcoleus paludosus在内的物种是家庭样品独有的，表明建立了栖息地特异的生态位。

洪水和非洪水组中的微生物重叠和独特类群

如果物种的相对丰度≥0.5%，则被认为存在于样品中，这是在通过中位测序深度标准化读数计数后有效进行的。一组核心的19个物种，包括前5个最丰富的类群，在所有条件下普遍存在。当排除核心组时，洪水组表现出更大的微生物重叠，共有45个共享物种，而非洪水对照仅有6个共享物种。洪水居住区含有137个非洪水对照中缺失的独特物种，包括与淡水和土壤生态位相关的类群，如Phormidium irriguum和Ancylothrix terrestris，以及来自Lacunisphaera属的物种。类似地，与农业对照相比，洪水农业样品包含127个独特物种，包括Sulfuricurvum sp.以及Nitrospira和Acidibacter属的成员。值得注意的是，Nitrospira属和Prolixibacteraceae科在对照样品中完全缺失，表明洪水驱动了微生物群落结构的显著变化。同样显著的是，对照组之间没有物种独家共享，而洪水组之间独家共享26个物种且在对照中缺失。这种模式可能反映了由于洪水农业和居住区域之间的水运动导致的微生物混合，创建了共享的生态位。然而，洪水组和对照组之间样本量的差异需要谨慎解释这些发现。

Alpha和Beta多样性

图4展示了跨样本组的Alpha和Beta多样性分析。图4a显示使用Chao1指数测量的每个组内的Alpha多样性。与非洪水对照相比，洪水样品表现出更高的Chao1值，表明更大的物种丰富度，并暗示洪水可能增强本地生物多样性。此外，家庭样品显示出比土地样品更高的指数，意味着家庭环境中更丰富的微生物多样性。

图4b说明了使用Bray-Curtis相异性评估的Beta多样性。同一组内的比较显示家庭和土地样品之间的平均距离相似；然而，土地样品在成对距离上表现出显著更高的变异性。这可能反映了土地样品中与家庭相比更大的环境异质性或更多样化的生态位。不同组样本之间，最大的平均Bray-Curtis距离在家庭和土地样品之间，而最小的距离在两个对照样品之间观察到。

为检查多样性指标的统计显著性，对Alpha和Beta多样性进行了Wilcoxon秩和检验。虽然观察到的物种丰富度和群落组成变化在统计上不显著，但需要注意的是，这种显著性的缺乏可能是由小样本量的有限统计功效所影响，而非构成组间真实生物学等效性的证据。

图4c描绘了基于Bray-Curtis距离的PCoA结果。虽然样本组被分离到不同的象限，但每组内点的广泛分散阻止了紧密簇的形成。

洪水中诱导的功能性微生物联合体在农业和居住土壤中

表1显示，共鉴定出29种微生物为洪水后引入，分为8个对土壤恢复关键的功能组。固氮微生物（如Derxia sp.、Oscillatoria sp.）在居住土壤中占主导，而农业土壤宿主溶磷菌（如Candidatus Koribacter）和植物生长促进根际细菌（如Paenibacillus chartarius）。有机分解者如Geobacter sp.（农业）和Paludibaculum fermentans（居住）展示了生态位特异性作用，而硫/铁循环者（如Sulfuricurvum sp.）和蓝细菌（如Phormidium irriguum）突出了洪水适应功能。值得注意的是，Derxia sp.和Candidatus Koribacter在两种土壤中均出现，表明跨环境效益。所有微生物均通过参考文献验证，确认它们对洪水影响生态系统中养分循环、土壤稳定和生物修复的贡献。

病原体筛选

针对NCBI RefSeq数据库中充分表征的人类致病物种（根据数据库的策展定义）进行了病原体筛选。该分析显示采样微生物群中无典型人类病原体。所有检测到的类群要么是无可知人类致病性的环境细菌，要么缺乏种级分辨率，无法明确评估其致病潜力。关键的是，这种无法将许多类群解析到种级水平意味着我们不能自信地排除潜在病原体的存在，因为毒力因子通常是物种或菌株特异性的。需要注意的是，该筛选针对的是已建立的病原体，并不排除机会性病原体的存在。一个单一的例外是Clostridium disporicum，一种革兰氏阳性厌氧细菌，在临床环境中很少分离，已与一例罕见的手术后感染病例相关。有趣的是，C. disporicum仅在非洪水农业对照样品中检测到，表明要么是局部环境储库，要么是采样过程中的潜在污染。

质量保证

与外部好氧土壤项目的比较揭示了关于洪水土壤样品有效性的关键见解。该项目识别了346个OTU，而外部研究报告了390个OTU，其中42个OTU（占本项目总数的12%）在两个项目之间共享。值得注意的是，洪水土壤丰度谱中前12个最丰富类群中的8个也存在于外部项目的数据集中。核心类群的显著重叠意味着采样和处理协议是一致和可靠的，因为共享的环境因素可能驱动了相似性。

与修改流程的比较用于评估生物信息学方法对分类学分辨率的影响。将原始的基于参考的流程与使用从头嵌合体去除和聚类的修改版本进行比较，后者生成了556个OTU。基于参考的方法中的所有346个OTU在从头结果中均保留，确认无论方法如何，核心类群都被一致识别。从头流程中更高的OTU计数与预期一致，因为该方法通过不依赖参考数据库的序列聚类检测更细粒度的多样性，捕获基于参考的方法可能排除的稀有或新谱系。

讨论

本研究提供了关于洪水对孟加拉国Feni的Chhagalnaiya居住和农业土壤环境中微生物群落影响的关键见解。最引人注目的发现之一是在2024年孟加拉国洪水后引入了29种功能多样性的微生物类群，涵盖八个生态角色，包括固氮菌（Derxia sp.、Oscillatoria sp.）、溶磷菌（Candidatus Koribacter）和硫循环者（Sulfuricurvum sp.），它们共同增强了养分循环和土壤稳定。然而，由于功能分析是从分类学推断而非宏基因组验证，这仍是一个待检验的假设。在此背景下，“有益”是根据它们在支持土壤健康和生态系统恢复力 through 关键生物地球化学过程方面的文献记录作用定义的，最终创造了支持作物生产力的条件。固氮蓝细菌在居住土壤中占主导，而农业土壤专门从事硫氧化，反映了对洪水条件的生态位特异性适应。值得注意的是，病原体 largely 缺失，Clostridium disporicum 仅在非洪水对照中检测到，这与洪水相关病原体增殖的报道形成对比。这些发现强调了洪水作为生态干扰者和微生物恢复力催化剂的双重作用。

Derxia sp.在农业和居住土壤中的双重存在表明其生态可塑性，使得对洪水后恢复关键的跨环境养分交换成为可能。居住土壤独特地宿主Lysobacter sediminicola，一种烃类降解细菌，而农业土壤保留Geobacter sp.，它促进铁介导的有机分解。尽管16S rRNA测序对未培养类群如Candidatus Koribacter的分辨率有限，但与外部数据集的交叉验证确认了核心类群的可靠性。洪水增加了微生物多样性，洪水组共享44个物种，而非洪水对照为6个，表明洪水驱动了微生物扩散。主导类群，包括Woesearchaeales古菌和Gemmataceae细菌，占群落的约50%。出现了栖息地特异性生态位：Moraxellaceae和Candidatus Solibacter是农业独有的，而Lysobacter sediminicola和Microcoleus paludosus是居住独有的。挑战包括丰富类群未解析的种级分类和仅在非洪水对照中检测到的Clostridium disporicum，使起源解释复杂化。Alpha多样性（Chao1）在洪水和居住样品中更高，而Beta多样性表明土地变异性，尽管没有统计显著性。虽然PCoA中的视觉趋势暗示潜在的洪水诱导变化，但分析并未提供统计上 robust 的证据表明洪水显著改变了该数据集中的微生物群落结构。

我们的发现与全球研究一致，表明洪水增强了微生物养分循环，并反映了孟加拉国的传统洪泛区农业，其中微生物驱动泥沙沉积和土壤肥力。然而，水传播病原体的缺失与洪水相关爆发的报道形成对比。虽然早期采样或方法学差异可能有所贡献，但当地环境条件也可能发挥关键抑制作用。例如，我们土壤样品中观察到的轻微碱性pH和升高的有机质含量可能创造了一个对常见肠道病原体增殖不太有利的环境，这些病原体通常在中性条件下茁壮成长。此外，来自 established, resilient 土著微生物群的潜在生物竞争可能胜过外来病原物种，阻止其成功定植。这突出了在评估洪水公共卫生风险时考虑当地土壤因素的需要。Woesearchaeales古菌和Gemmataceae细菌的主导地位，先前在温带洪泛区观察到，将其生态角色扩展到热带三角洲生态系统，强调了它们的普遍意义。这些见解提供了可操作策略：用Paenibacillus spp.进行生物强化可以改善作物的磷可用性，而Lysobacter sediminicola可以减轻城市内涝影响。将微生物见解整合到孟加拉国的气候适应框架中可以使洪水管理与生态恢复保持一致。未来的研究应优先考虑多组学方法以解析代谢途径和纵向研究以追踪微生物演替。通过利用洪水诱导的微生物群落，我们将脆弱性转化为恢复力，重新定义三角洲地区的洪水缓解。

关键限制包括由于16S rRNA测序无法解析物种或菌株水平功能而导致的分类学分辨率挑战，小样本量降低统计功效，以及依赖不完整的病原体数据库。本研究的一个主要限制是依赖16S rRNA基因扩增子测序来推断微生物功能。由于功能性状并不总是在此处解析的分类学水平上保守，这些预测仍然是推测性的。未来采用鸟枪法宏基因组学的研究对于直接表征微生物群落的代谢潜力和功能基因至关重要。另一个限制是非洪水对照样品缺乏技术重复，这是野外访问限制的结果。虽然这些对照提供了有价值的初步基线，但涉及它们的比较应谨慎解释。未来需要更大样本量的研究来确认这些初步发现的稳健性。SILVA 138参考数据库，虽然对广泛群落分析具有成本效益，但缺乏严格的种级策展，通常将分类限制在属或科级，特别是对于未培养类群。这种粒度差距使病原体筛选和功能注释复杂化。此外，研究的横断面设计排除了关于洪水诱导微生物变化的因果推断。未来的研究应整合鸟枪法宏基因组学以解析菌株水平角色和纵向采样以追踪微生物演替，解决这些约束并增强生态见解。

这些发现突出了洪水对微生物群落的深远影响，并强调了在洪水易发区需要强大的监测系统来评估公共卫生风险。洪水环境中独特微生物类群的识别为进一步研究其生态作用和潜在应用（如生物修复或农业改进）奠定了基础。未来的研究应优先考虑纵向采样以追踪微生物动态，扩大样本量以提高统计功效，并整合功能宏基因组学以阐明洪水相关微生物的代谢能力。此外，鸟枪法宏基因组学可以增强分类学分辨率并检测毒力或抗生素抗性基因，提供更全面的公共卫生风险视图。制定病原体筛选标准化协议并促进环境科学家和公共卫生机构之间的合作对于将这些见解转化为可操作策略至关重要。通过采用这些方法，我们可以更好地准备和减轻孟加拉国等脆弱地区洪水的健康和环境 impacts。