非侵入性水下DNA采样技术揭示红海棘皮动物多样性及其对海洋生物多样性保护的革新意义

《Molecular Ecology Resources》：Non-Invasive Underwater DNA Sampling Illuminates Red Sea Echinoderm Diversity

本研究开发了一种创新的非侵入性水下DNA采样方法，通过无菌拭子采样盒在红海棘皮动物中成功应用。该技术实现了水下原位遗传材料采集（COI基因条形码），相比传统组织活检具有快速（<1分钟/样本）、低成本、非破坏性等优势，PCR扩增成功率达88%，测序成功率达94%。该方法为脆弱生态系统和濒危物种研究提供了伦理合规的解决方案，显著推进了海洋生物多样性评估（eDNA metabarcoding）和种群遗传学研究。

　　

ABSTRACT

物种特异性非侵入性水下DNA采样对海洋无脊椎动物的研究仍处于空白状态，尽管该技术具有革新脆弱物种和生态系统生物多样性评估的潜力。本研究以红海棘皮动物为案例，开发了一种适用于水下遗传材料采集的原位拭子采样方案。使用新设计的水下采样套件（含无菌口腔拭子和水下采样容器），对五类棘皮动物超过50种的308个个体进行采样。与传统组织DNA提取方法相比，拭子法的DNA产量较低但足以支持所有下游应用，总体PCR扩增成功率达88%（240/274），测序成功率达94%（202/214），且DNA完整性无显著差异。对231个标本的系统发育分析揭示了37个进化枝，包括20个新的红海谱系以及对隐存种和稀有种的初步鉴定。该技术适用于挑战性野外条件，为研究高风险生态系统和物种提供了高效替代方案。

1 Introduction

生物多样性丧失是人类世最紧迫的后果之一，而物种鉴定和监测的"分类学瓶颈"严重制约了保护工作。DNA条形码技术（特别是线粒体COI基因）已成为物种鉴定的核心工具，但传统采样方法具有破坏性且受法规限制。环境DNA（eDNA）宏条形码技术虽具潜力，但依赖参考数据库的完整性。目前非侵入性DNA采样方法主要针对脊椎动物，无脊椎动物研究仅占6%。海洋无脊椎动物采样面临水下操作困难、保存运输挑战等特殊问题。

2 Red Sea Echinoderms as a Case Study

棘皮动物是最大的海洋无脊椎动物门类，在珊瑚礁生态系统中具有重要生态功能。红海作为内海盆地具有高度特有性，但该区域棘皮动物的分类学研究主要基于早期探险的形态学鉴定。海参等类群的分类严重依赖显微镜下骨片结构，且形态特征常不足以准确鉴定物种。此前在海参中应用的拭子法已证明可成功用于DNA提取和性别鉴定，但均在实验室条件下进行。

3 Methods

3.1 Swabbing Kit Design and Deployment

设计基于Balázs等人的改进型保存系统，采用5mL PET瓶与翻转盖结构，预装保存缓冲液（100%分子级乙醇或RNA Save）并用Parafilm密封。水下采样时拭子刺破Parafilm膜进入保存液，最大限度减少海水混合。样本在18-40°C室温下保存1-47天后进行DNA提取。

3.2 Sampling

2019年3月至2024年9月期间通过水肺潜水在红海19个站点采样，主要集中于北亚喀巴湾。采样涵盖所有五类棘皮动物，同时测试了鱼类和石珊瑚等类群的适用性。

3.3 Post Sampling Preservation Comparisons

通过对照实验比较拭子法与组织活检的DNA产量和完整性，并评估不同保存介质（乙醇vs RNA Save）和温度条件的影响。

3.4 DNA Extraction

采用GeneAid gSYNC DNA提取试剂盒，增加涡旋时间至10秒，用预热的56°C洗脱缓冲液进行二次洗脱。

3.5 DNA Yield, Purity and Integrity

使用NanoDrop 1000分光光度计、Qubit 4荧光计和Agilent 4200 TapeStation系统分别检测DNA浓度、纯度和完整性。

3.6 PCR Amplifications

使用多组引物扩增线粒体COI基因：棘皮动物采用COIceF/COIceR、COIe-F/COIe-R和COI16bf/COIer；刺胞动物使用HCO2198/LCO1490；鱼类采用Fish_F1m/Fish_R2m等简并引物。

3.7 Sequence Processing and Phylogenetic Analysis

使用SeqTrace 0.9.0编译共识序列，AliView 1.28进行比对。采用最大似然法（IQ-TREE）和贝叶斯推断（MrBayes 3.2.7）进行系统发育分析。

3.8 Statistical Analyses

使用R 4.4.0进行Welch t检验和双因素方差分析，比较DNA产量和完整性差异。

4 Results

4.1 采样效率与成功率

总计308个样本中，88%的棘皮动物拭样成功扩增，94%成功测序。珊瑚样本扩增成功率达87.5%，鱼类样本全部成功。拭子法DNA产量（中位数293μg）显著低于组织法（9420μg），但完整性无显著差异（DIN值6.03 vs 5.23）。乙醇保存效果显著优于RNA Save，温度条件无显著影响。

4.2 系统发育分析

4.2.1 Echinoidea

多数海胆形态种鉴定正确，但 Irregularia sp.等类群形成独特进化枝。Echinostrephus molaris（钻孔海胆）和Parasalenia poehlii等稀有物种首次获得遗传数据。红海种群与印度洋种群出现遗传分化，如Echinothrix calamaris形成独立进化枝。

4.2.2 Asteroidea

Leiaster leachi、Culcita coriacea等物种获得首个序列数据。Acanthaster benziei（红海特有冠刺星）在整个红海分布得到确认。Linckia multifora与L. laevigata形成多系群，COI序列相似度达98%。

4.2.3 Crinoidea and Ophiuroidea

海百合和蛇尾类多数无法现场鉴定，依赖DNA条形码进行物种划分。三例海百合样本与Heterometra africana聚类（该物种未在红海记录）。Astroboa nuda（筐蛇尾）在亚喀巴湾种群与公共序列出现显著遗传分化。

5 Discussion

5.1 The Swabbing Protocol

该技术对珊瑚礁等敏感环境尤为重要，可在1分钟内完成采样，单次潜水可采集60个样本。相比eDNA宏条形码，该方法能提供物种特异性高质量参考序列。液体填充设计克服了商业"干燥管"在10米水深即无法开启的技术难题。

5.2 DNA Extraction and Preservation

分子级乙醇在室温下即可有效保存，成本低廉且易于获取。低产量样本可能源于采样部位选择不当或抑制剂存在，采用低产量专用提取试剂盒可改善扩增效率。

5.3 The Case Study of Red Sea Echinoderms

红海种群呈现显著的遗传独特性，如Echinostrephus molaris与印度洋种群分离并成为E. aciculatus的姐妹群。 Strait of Bab al Mandab作为生物地理屏障塑造了红海特有性模式。

6 Conclusions

该非侵入性DNA采样方法成功应用于红海棘皮动物多样性研究，为脆弱生态系统的遗传筛查提供了可持续技术方案。新获得的条形码序列为整合形态学、分子学和生态学的综合分类学研究奠定了基础，对推动海洋保护具有重要实践价值。