抑制DHHC9介导的CD36棕榈酰化通过JNK-ERK通路减轻高脂饮食诱导的青春期乳腺发育障碍

《Cellular & Molecular Biology Letters》：Inhibition of DHHC9-mediated CD36 palmitoylation lessens high-fat diet (HFD)-induced impairment of pubertal mammary gland development through the JNK-ERK pathway

本研究针对高脂饮食（HFD）诱发的青春期乳腺发育障碍问题，揭示了CD36蛋白棕榈酰化修饰的关键作用。研究人员通过体内外实验证实，棕榈酰化抑制剂2BP、DHHC9敲低和CD36半胱氨酸位点突变均能抑制CD36膜定位及CD36/Fyn/Lyn复合物形成，进而阻断JNK1通路并激活ERK1/2信号，最终逆转棕榈酸（PA）对HC11细胞增殖的抑制并改善HFD小鼠乳腺发育。该研究为营养干预乳腺发育异常提供了新靶点，对肥胖相关乳腺疾病防治具有重要理论意义。

　　

青春期乳腺发育是哺乳动物乳腺功能建立的关键阶段，其异常调控可能导致后续泌乳功能障碍甚至乳腺癌发生。近年来，高脂饮食（HFD）对乳腺发育的负面影响逐渐引起关注，但具体分子机制尚未明确。棕榈酸（PA）作为HFD中最丰富的脂肪酸，可通过蛋白质棕榈酰化修饰影响细胞功能。CD36作为脂肪酸转运蛋白，其棕榈酰化修饰是否参与HFD诱导的乳腺发育障碍，成为值得深入探究的科学问题。

本研究主要采用以下技术方法：使用HC11小鼠乳腺上皮细胞构建体外高脂模型（200μM PA处理）；通过酰基-生物素交换（ABE）法检测蛋白质棕榈酰化水平；利用免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白相互作用；采用免疫荧光技术观察蛋白亚细胞定位；通过EdU染色评估细胞增殖能力；构建DHHC9敲低（sgDHHC9）和CD36棕榈酰化位点突变（AA-SS）细胞模型；使用JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂U0126进行通路验证；在体内采用4周龄C57BL/6J雌鼠建立HFD模型（60%脂肪供能），通过腹腔注射棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸（2BP，20mg/kg）进行干预，最后利用乳腺全mount染色评估形态学变化。

研究结果

棕榈酰化抑制剂2BP逆转PA抑制的HC11细胞增殖

通过EdU检测发现，PA处理显著降低HC11细胞增殖率，而2BP处理可逆转这种抑制效应。Western blot结果显示2BP上调增殖标志蛋白PCNA表达，并激活ERK1/2信号通路，表明抑制棕榈酰化可改善PA引起的细胞增殖障碍。

2BP降低PA处理后CD36的膜棕榈酰化与定位

ABE实验显示PA促进CD36总棕榈酰化和膜棕榈酰化水平，2BP处理则显著抑制这一过程。免疫荧光染色证实2BP减少CD36与膜标志物Na⁺,K⁺ ATPase的共定位，表明棕榈酰化修饰调控CD36膜定位。

2BP抑制DHHC9与CD36的结合

qPCR检测发现PA上调DHHC4、DHHC7和DHHC9表达，2BP处理逆转该效应。Co-IP实验进一步证实2BP特异性抑制DHHC9与CD36的结合，而对DHHC4或DHHC7与CD36的结合无影响，提示DHHC9是介导CD36棕榈酰化的关键酶。

DHHC9敲低抑制CD36棕榈酰化并促进细胞增殖

构建DHHC9敲低细胞模型后，ABE检测显示CD36棕榈酰化水平显著降低，免疫荧光显示CD36膜定位减少。功能实验表明DHHC9敲低增加EdU阳性细胞比例，上调PCNA表达并激活ERK1/2通路，证明靶向DHHC9可改善PA诱导的增殖抑制。

CD36半胱氨酸位点突变抑制其膜定位并促进增殖

通过构建CD36棕榈酰化位点突变体（AA-SS），发现突变体细胞中CD36棕榈酰化和膜定位显著降低。同时，突变体细胞表现出更强的增殖能力和ERK1/2通路激活，证实CD36棕榈酰化修饰直接调控细胞增殖过程。

抑制CD36棕榈酰化减少CD36/Fyn/Lyn复合物形成并调控JNK1-ERK1/2通路

Co-IP实验表明2BP处理、DHHC9敲低和CD36突变均降低CD36与Fyn/Lyn的结合。Western blot显示这些干预措施抑制JNK1磷酸化而激活ERK1/2磷酸化。使用JNK抑制剂SP600125可模拟2BP效应，促进细胞增殖并激活ERK1/2，而ERK抑制剂U0126则消除2BP的促增殖作用，证实JNK1-ERK1/2通路的级联调控关系。

2BP改善HFD小鼠青春期乳腺发育障碍

体内实验显示2BP处理显著改善HFD小鼠乳腺导管分支和终末芽孢（TEB）数量，增加乳腺组织PCNA表达。机制上，2BP抑制乳腺组织CD36棕榈酰化，减少CD36/DHHC9结合和CD36/Fyn/Lyn复合物形成，并调控JNK1-ERK1/2信号通路，证实2BP通过相同机制缓解HFD引起的乳腺发育障碍。

研究结论与意义

本研究首次揭示DHHC9介导的CD36棕榈酰化在高脂饮食诱导的青春期乳腺发育障碍中的关键作用。通过体内外实验证明，抑制CD36棕榈酰化可减少其膜定位及与Fyn/Lyn的复合物形成，进而抑制JNK1信号并激活ERK1/2通路，最终促进乳腺上皮细胞增殖和乳腺导管发育。该研究不仅阐明了营养因素调控乳腺发育的新机制，还为肥胖相关乳腺疾病的干预提供了潜在靶点——针对DHHC9-CD36棕榈酰化轴的调控可能成为改善代谢异常所致乳腺发育障碍的有效策略。