番茄中基于最小前体合成反式作用小干扰RNA的精准RNA干扰技术及其应用

《Plant Biotechnology Journal》：Precision RNAi in Tomato Using Synthetic Trans-Acting Small Interfering RNAs Derived From Minimal Precursors

本文介绍了一种在番茄中利用内源性SlmiR482b microRNA触发的最小合成反式作用小干扰RNA（syn-tasiRNA）前体进行精准基因沉默的新平台。该技术通过仅包含22核苷酸（nt）miRNA靶位点、11 nt间隔序列和syn-tasiRNA序列的最小前体，在转基因和瞬时病毒诱导基因沉默（syn-tasiR-VIGS）系统中高效产生功能性syn-tasiRNAs。研究团队开发了高通量B/c载体系统，证实该平台可有效沉默番茄内源基因（如SlSFT）并赋予对番茄斑萎病毒（TSWV）的抗性。特别值得注意的是，通过粗提物递送实现了无转基因syn-tasiR-VIGS技术，为作物功能基因组学和遗传改良提供了强大工具。

　　

RNA干扰（RNAi）是一种在植物中高度保守的基因沉默机制，通过互补的20-24核苷酸（nt）小RNA分子介导靶信使RNA的特异性降解或翻译抑制。合成反式作用小干扰RNA（syn-tasiRNA）作为第二代RNAi策略，能够通过精确设计的21 nt人工小RNA实现高特异性基因沉默，但传统方法因需要转基因整合和前体长度较长而应用受限。

本研究成功开发了基于最小前体的番茄syn-tasiRNA平台。该平台利用内源性22 nt SlmiR482b microRNA触发，其最小前体仅包含三部分：22 nt miRNA靶位点（TS）、11 nt间隔序列（源自AtTAS1c）和syn-tasiRNA序列。通过农杆菌浸润实验证实，SlmiR482bTS前体比SlmiR6020TS前体更高效地产生syn-tasiRNA，其积累水平与阳性对照（共表达AtTAS1c-NbSu和AtMIR173a）相当。

为促进高通量应用，研究人员构建了两种新型B/c载体：Gateway兼容的入门载体pENTR-SlmiR482bTS-B/c和可直接用于转化的二元载体pMDC32B-SlmiR482bTS-B/c。这些载体采用简化克隆策略，通过BsaI限制性内切酶位点和ccdB负筛选标记实现定向连接，显著提高了克隆效率。

在功能验证方面，针对番茄开花关键调控基因SINGLE FLOWER TRUSS（SlSFT）设计的syn-tasiR-SlSFT在转基因番茄中表现出显著表型效应。T1代转基因株系在5周后显示开花延迟，第一花序出现前的叶片数增加至13-15片（非转基因对照为10片）。分子分析证实SlSFT mRNA水平显著降低，5′-RLM-RACE检测到精确的靶标切割，小RNA测序显示87%的 reads为准确的21 nt syn-tasiR-SlSFT，且加工相位精度达98%。

在抗病毒应用方面，PVX载体表达的四个靶向TSWV保守区域的syn-tasiRNAs（syn-tasiR-TSWV-1至4）有效保护番茄免受病毒感染。接种14天后，处理植株保持无症状且病毒积累检测不到，而对照植株（表达抗GUS syn-tasiRNAs或AtmiR173aTS前体）均出现典型症状。Northern blot证实抗病毒syn-tasiRNAs的高效积累。

特别值得注意的是，研究实现了无转基因的syn-tasiR-VIGS技术。通过本氏烟制备的PVX粗提物喷雾接种番茄，成功沉默内源基因SlSu和SlDXS，导致叶片白化表型。RT-qPCR显示靶基因mRNA水平显著降低，且PVX和前体序列检测阳性，证明该递送系统的有效性。

与其它RNAi策略的比较显示，syn-tasiRNA技术具有独特优势。相较于 miRNA诱导基因沉默（MIGS），syn-tasiRNA对SlDXS的沉默效率更高；与外源dsRNA相比，针对TSWV M片段的dsRNA虽能提供相当抗性，但syn-tasiRNA的多靶点设计可降低病毒逃逸风险。

该技术的创新性体现在多个方面：最小前体显著降低合成成本和提高载体稳定性；B/c载体系统简化了操作流程；SlmiR482b内源触发机制避免外源miRNA共表达需求；粗提物递送为无转基因作物改良提供新途径。然而，该技术的物种特异性（需鉴定有效内源22 nt miRNA）、病毒载体选择以及监管政策等因素仍需进一步优化。

综上所述，本研究建立的番茄syn-tasiRNA平台为作物精准基因功能研究和遗传改良提供了高效工具，在农业生物技术领域具有重要应用前景。