液态环境中动物细胞的红外纳米成像与光谱学研究：基于SiC膜技术的生物相容性界面与纳米红外断层扫描新策略

《Small》：Nano-Infrared Imaging and Spectroscopy of Animal Cells in Liquid Environment

本文系统介绍了利用散射型近场光学显微镜（s-SNOM）结合碳化硅（SiC）超薄膜技术，在液态环境中实现动物细胞纳米级红外光谱（nano-IR）成像的创新方法。该研究通过优化原子力显微镜（AFM）探针-样品相互作用参数，显著提升信噪比，并首次提出基于单解调谐波的纳米红外断层扫描技术，为活细胞生物分子异质性研究提供了突破性技术平台。

　　

1 引言

红外纳米光谱技术（nano-IR）通过散射型近场光学显微镜（s-SNOM）已成为分析完整样品纳米尺度体积内振动光谱的重要工具。近年来，利用超薄膜技术的s-SNOM实验使得液态环境中细胞和生物分子的纳米级研究成为可能。本研究报道了使用碳化硅（SiC）膜作为细胞培养基与s-SNOM原子力显微镜（AFM）探针间的稳定生物相容性界面，确保在1050 cm^?1以上进行宽带纳米红外实验。通过宽带同步辐射红外光源，从生长在膜上的成纤维细胞收集纳米红外图像和光谱，探测膜相邻细胞区域。优化的探针-样品相互作用显著提高了纳米红外成像的信噪比。

2 结果与讨论

2.1 SiN与SiC膜的红外光学特性

通过远场透射和近场相移光谱比较10 nm氮化硅（SiN）和30 nm碳化硅（SiC）膜的光学特性。SiC膜在1000-2000 cm^?1范围透光度较低，因其折射率（n_SiC≈3）高于SiN（n_SiN≈2.3）。SiC的声子带红移且更尖锐，其表面声子极化激元效应在800-1000 cm^?1范围产生特征响应。尽管SiC膜更厚，但其声子和极化激元模式能量较低，使得红外透明窗口可扩展至≈1000 cm^?1以上。

2.2 基于SiC膜的细胞液态环境纳米红外成像

小鼠成纤维细胞系3T3在SiC膜上生长良好并达到汇合。通过可见光透射显微镜可清晰区分细胞核等亚细胞结构，反射模式因SiC高折射率（3.3-3.5）仅能分辨细胞轮廓。s-SNOM实验显示机械相位信号稳定，而近场红外光学图像能以更高空间分辨率解析细胞形态。细胞与膜之间的粘附强度影响成像对比度，暗区对应较弱粘附区域，反映了细胞膜结构的天然异质性。

2.3 探针-样品相互作用对成像质量的影响

SiC膜允许AFM探针在20-130 nm敲击振幅和55%-85%设定点范围内稳定工作。增加敲击振幅和降低设定点可提升信号探测深度，但会牺牲面内空间分辨率。通过分析不同解调谐波（s₁, s₂, s₃）发现，高阶谐波能更好抑制背景信号。实验数据表明可通过单一解调谐波实现纳米红外断层扫描，为液态环境三维化学成分重构提供新方法。

2.4 液态环境细胞纳米红外光谱

在1050 cm^?1以上光谱范围内，从固定细胞和活细胞中成功获取纳米红外光谱。酰胺I带（1622-1652 cm^?1）和酰胺II带（1522-1546 cm^?1）为主要特征峰，同时检测到碳水化合物C-O伸缩振动（1055/1110 cm^?1）、DNA磷酸基团振动（≈1080/1215 cm^?1）和脂类特征峰（CH₂变形1455 cm^?1，C=O伸缩1730-1750 cm^?1）。不同位点光谱显示蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物分布的纳米级异质性，与表面增强拉曼散射（SERS）研究结果一致。

2.5 SiN与SiC膜的对比应用

10 nm SiN膜同样支持细胞生长和纳米红外检测，但其在800-1200 cm^?1范围的振动峰可能引起光谱伪影。SiC膜凭借更宽的红外透明范围和更高的机械稳定性，在生物分子低频振动检测方面更具优势。两种基底上的细胞光谱特征总体一致，但SiC膜在光谱数据可靠性方面表现更佳。

3 结论

本研究实现了通过超薄膜技术在液态环境中对生物样品进行纳米红外成像和光谱采集，成功应用于细胞培养基中的活细胞研究。优化后的探针-样品相互作用机制显著提升数据质量，开创性地提出基于单一解调谐波的s-SNOM纳米断层扫描方法。纳米红外光谱与远场光谱的相似性为生物分子解析提供基础，同时揭示了细胞化学成分的纳米级异质性。SiC膜在拓宽光谱范围和提高实验可靠性方面的优势，为未来生物材料界面研究和液体环境反应监测奠定了技术基础。

4 实验方法

使用250μm×250μm×10 nm SiN膜和200μm×200μm×30 nm SiC膜，经空气等离子体和紫外处理提高亲水性。3T3成纤维细胞在膜上培养24小时后，分别进行固定（PBS缓冲液）和活体（完全培养基）检测。s-SNOM实验使用Pt-Ir涂层AFM探针，在振幅调制模式下工作，利用同步辐射宽带红外光源收集纳米红外图像和光谱。光谱数据处理采用非对称切趾函数和零填充技术，光学图像通过Gwyddion软件进行预处理。