基于IR780靶向CD300LF/MRC1的DLD-HLNP纳米粒高效靶向肺实质递送吡非尼酮治疗特发性肺纤维化

《VIEW》：DLD-HLNP/P@IR780 for efficient lung-parenchyma accumulation to treat idiopathic pulmonary fibrosis

本文报道了一种新型树枝状-线性-树枝状聚合物杂化脂质纳米粒（DLD-HLNP@IR780），其通过表面暴露的IR780碘化物与肺内皮细胞特异性高表达的CD300LF和肺巨噬细胞高表达的MRC1的高亲和力结合，实现了高效的肺实质靶向积累（肺/肝比率高达20-30），并成功负载吡非尼酮（Pirfenidone）用于治疗特发性肺纤维化（IPF），为肺部疾病纳米药物的开发提供了新策略。

　　

摘要

高效肺靶向是纳米药物治疗肺部疾病的关键标准。有效载荷向肺实质的递送效率低，主要受到网状内皮系统（RES）清除和肺内皮细胞屏障（ECB）阻碍的影响。本研究发现了树枝状-线性-树枝状聚合物杂化LNP@IR780（DLD-HLNP@IR780）纳米颗粒具有高效的肺靶向能力，可实现高达20至30的肺/肝比率。靶向机制的探索揭示，IR780碘化物对CD300LF和MRC1具有高亲和力，这两种蛋白分别在肺内皮细胞（ECs）和巨噬细胞上特异性表达。CD300LF介导DLD-HLNP@IR780纳米颗粒穿越内皮细胞，而巨噬细胞通过MRC1帮助纳米颗粒在肺实质中聚集。负载吡非尼酮的DLD-HLNP@IR780纳米颗粒（DLD-HLNP/P@IR780）被用于实现吡非尼酮的肺实质靶向释放以治疗特发性肺纤维化（IPF），并表现出有效延缓IPF进展的效果。这为构建肺靶向纳米药物治疗多种肺部疾病提供了一种简便而有效的策略。

1 引言

纳米囊泡不仅能改善药物溶解度，还能减少所载药物的排泄/代谢/生物毒性，从而促进治疗效果，已被用于开发治疗肺部疾病的纳米药物。肺靶向抗体或肽，如ICAM-1、SP-A、GALA肽、LET肽和VCAM-1，被偶联到治疗剂上以实现纳米载体在肺部的积累。一种名为选择性器官靶向（SORT）的前瞻性策略被提出，通过添加带电脂质来改变纳米颗粒的表面电荷，从而控制脂质纳米粒（LNPs）的生物分布。最近，LNP的设计集中在从包含不同头基、链和残基的脂质库中筛选具有肺靶向潜力的脂质。

逃避网状内皮系统（RES）的摄取是肺靶向纳米载体面临的第一个挑战，因为具有渗漏和不连续内皮单层的RES器官会捕获和清除纳米颗粒。只有穿透内皮细胞屏障（ECB）并到达病理组织的纳米颗粒才能启动有效的治疗作用。肺靶向治疗的障碍是肺外积累和肺实质渗透不足。根据近期文献数据，由于肺外摄取，大多数纳米平台未能达到令人满意的肺/肝比率（大约在1到15之间），导致肺靶向递送效率低下。值得注意的是，显示出相对较高肺/肝比率的纳米颗粒中有60%–90%被肺内皮细胞截留。除了ECB，肺中的边缘中性粒细胞，即驻留在肺毛细血管中的一群中性粒细胞，作为RES的一部分，阻止纳米载体侵入肺内皮。因此，无论是靶向内皮细胞的抗体偶联，还是筛选具有肺偏好性的新形成脂质结构，都不被认为是将药物递送至肺实质的有效策略。

SORT技术通过改变表面电荷来控制LNPs的生物分布，在肺部显示出良好的递送效率；然而，具有高正/负表面电荷的LNPs的毒性是一个尚未阐明的问题。最近的一项研究报道了一种通过靶向肺小窝实现的高效肺实质递送策略，实现了纳米颗粒向间质组织的主动泵送。然而，该泵送系统的效率受到小颗粒尺寸的严格限制；据报道，20 nm尺寸纳米颗粒的肺靶向能力远优于40 nm尺寸的纳米颗粒。

IR780碘化物被认为是一种肿瘤靶向近红外荧光探针。在我们之前的研究中，我们注意到IR780碘化物可以有效地在肺部积累。类似的现象也在其他研究中被报道，但并非所有负载IR780碘化物的纳米颗粒都显示肺部积累。通过研究先前报道的含有IR780碘化物的纳米载体，我们发现只有表面固定了IR780且未对IR780化学结构进行修饰的纳米载体才表现出肺部积累。因此，我们假设IR780碘化物的分子结构对其肺靶向行为至关重要。然而，IR780碘化物肺靶向能力的机制尚未被探索。

在本文中，我们制备了含有IR780碘化物的树枝状-线性-树枝状杂化LNP，即DLD-HLNP@IR780，以揭示其肺靶向机制。DLD-HLNP@IR780纳米颗粒能在0.5小时内有效穿透肺ECB，而不会突破肝血窦或脾血窦，并迅速在肺部积累，肺/肝比率超过30。DLD-HLNP@IR780纳米颗粒由于IR780碘化物对CD300LF的高亲和力而被肺内皮细胞内化，CD300LF是一种在肺内皮细胞和巨噬细胞中特异性高表达的跨膜蛋白。纳米颗粒通过肺巨噬细胞进入间质组织，因为IR780碘化物对MRC1也具有高亲和力，MRC1也是一种在肺巨噬细胞上特异性高表达的跨膜蛋白。

肺靶向DLD-HLNP@IR780纳米颗粒被用于负载吡非尼酮（DLD-HLNP/P@IR780）治疗特发性肺纤维化（IPF）。IPF是一种以肺内纤维组织进行性沉积为特征的间质性肺炎。其总体预后差促使研究人员和医生优化临床用药。吡非尼酮是临床推荐的一线治疗方法之一，口服给药剂量从200 mg每日三次开始，逐渐增加至最大剂量1800 mg/天，这会引起胃肠道常见不良反应、肝功能异常、皮疹和光过敏。在博来霉素诱导的小鼠IPF模型中取得了令人兴奋的治疗结果。

2 实验流程

2.1 材料

Bis-MPA超支化PEG10k-OH（伪G3）、PFH-16-OH和胆固醇购自Sigma Aldrich；DMG-PEG2000、Dlin-MC3-DME、DDAB、DSPC、DSPA、DMPA、DOPA、DDAB和DMG-PEG2000购自西安瑞禧生物科技；透析袋（MD55, 3500D）购自Solarbio，Amicon? Ultra-15购自Merck Millipore。蛋白质及相关试剂的信息以及仪器信息在后续内容中相应注明。本研究中描述的所有动物实验均按照重庆大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

2.2 L-HLNP@IR780纳米颗粒的合成与表征

将Bis-MPA超支化PEG10k-OH（伪G3）、MC3、DSPC、胆固醇和DMG-PEG 2000以特定摩尔比（5:45:10:10:5）溶解于乙醇中，并与IR780碘化物（溶解于DMSO）混合，随后搅拌并加热至50°C，将三倍体积的MES缓冲液（pH 4.0）滴加到乙醇混合物中，磁力搅拌2分钟形成DLD-HLNP@IR780，随后进行冰浴、超滤和PBS（pH 7.3）透析。最终产物储存于4°C。L-HLNP/P@780按照相同程序合成，吡非尼酮溶解在乙醇相中。水合粒径和Zeta电位通过DLS（动态光散射）检测。纳米颗粒的实际尺寸和形态通过负染透射电子显微镜（TEM）观察。

2.3 纳米颗粒的细胞毒性

将无污染的LLC（Lewis肺癌）细胞以2000细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜。将L-HLNP@IR780用培养基稀释至不同浓度（0.1987, 0.3973, 0.5960, 和 0.7947 mg/10⁵ 细胞）；弃去板中的培养基，更换为含DLD-HLNP@IR780的培养基（100 μL/孔），共孵育24小时后，通过CCK8试剂盒（碧云天生物技术）检测细胞活力。

2.4 肺靶向过程的观察

通过在不同时间点收集的组织样本进行荧光检测来观察肺靶向过程。

雄性C57 BL/6N小鼠通过尾静脉注射200 μL DLD-HLNP@IR780（1 mg/mL），并在1、2.5、9、24、48和72小时处死。通过荧光成像（PerkinElmer IVIS lumina III）（Ex/Em = 740 nm/790 nm）检测每个时间点收集的主要器官中纳米颗粒的荧光。

雄性Balb/c裸鼠通过尾静脉注射250 μL纳米颗粒（mg/mL），并在0.5、1、2、3、4、5、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240和264小时进行吸入麻醉（异氟烷）处理。检测荧光信号以显示纳米颗粒的生物分布并证明体内肺靶向过程。

2.5 IPF小鼠模型的建立

将雄性C57 BL/6N小鼠（30只）通过腹腔注射戊巴比妥溶液（0.7%, 250 μL）麻醉，并通过气管内滴注博来霉素溶液（5 mg/mL, 50 μL）给药。将小鼠随机分为两组，包括用DLD-HLNP@IR780处理的对照组和用DLD-HLNP/P@IR780处理的实验组。治疗从第12天开始，到第30天结束。

2.6 治疗效果检查

治疗方案设定为每隔一天通过尾静脉注射相应的纳米颗粒（1 mg/mL, 300 μL），共四次注射。

末次注射后三天，每组处死五只小鼠。收集小鼠肺脏制备单细胞悬液。详细来说，将肺组织切成小块，用胶原酶（II型：1000 U/mL, PBS, Worthington）和分散酶II（11 U/mL, PBS, Gibco）在37°C消化30分钟，用10% FBS终止反应，细胞悬液通过细胞筛（40 μm）过滤获得单细胞悬液。离心后收集细胞沉淀，用3 mL红细胞裂解液在室温处理3分钟，用9 mL冷MACS缓冲液（1% FBS + PBS）终止反应。最后，悬液离心并重悬。免疫细胞用相应的荧光标记抗体在冰上标记30分钟。然后用冷MACS洗涤混合物，抗体标记的细胞通过离心（1700 rpm, 8分钟）收集，用400 μL MACS重悬并通过流式细胞术检测。

每组小鼠用戊巴比妥麻醉采集血样，其中6份样本在第22天采集，其余样本在治疗结束时采集。血样以4000 rpm离心3分钟分离血清。通过ELISA（酶联免疫吸附测定）（ServiceBio）检测KL-6和SP-A的水平。治疗结束时，采集每组小鼠的肺组织制备冰冻切片，随后按照方案进行IHC染色（免疫组织化学染色）。在显微镜下观察结果。在第30天，按上述方法制备冰冻切片（6 μm）。按照常规方案进行H&E染色（苏木精-伊红染色），在显微镜下观察结果。

在第30天，按上述方法制备冰冻切片。冰冻切片中的胶原用天狼星红染色1小时，细胞核用苏木精染色10分钟（天狼星红染色液，北京索莱宝科技有限公司）。在显微镜下观察结果。

在第30天，收集肺组织并切成小块。每个样本使用50 mg肺组织通过羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行胶原定量。检测按照制造商方案进行。每毫克肺组织胶原实际含量的计算采用以下方程：

C = (A * V) / W

其中C为含量；A为吸光度；V为体积，W为重量。

2.7 肺靶向影响因素的探索

IR780类似物改变生物分布的验证：使用IR780的类似物，包括IR676、IR775和IR783，基于相同的DLD-HLNP@IR780框架合成不同类型的纳米颗粒。所有四种分子溶液均通过溶解于DMSO（10 μL）并用PBS（1 mL）稀释制备。在验证生物分布前，制备每种类型的纳米颗粒并通过DLS测量其尺寸和Zeta电位。将27只雄性C57 BL/6N小鼠随机分为三组，通过尾静脉注射相应类型的纳米颗粒，并在24、48和72小时后处死。通过PerkinElmer IVIS系统在相应波长下检测主要器官的荧光信号（IR676的Ex/Em = 640 nm/680 nm，IR 775、IR780和IR783的Ex/Em = 740 nm/790 nm）。

DLD-HLNP@IR780在体内的渐进定位：给C57 BL/6N雄性小鼠注射L-HLNP@IR780（1 mg/mL, 200 μL），并在注射后不同时间点（0.5、1、2、4、24、48和120小时）处死。进行荧光成像（Perkin Elmer）后，收集器官（肝、脾和肺）制备冰冻切片。细胞核用DAPI染色。每个时间点的肝、肺和脾冰冻切片通过LSCM（激光扫描共聚焦显微镜）（Leica）观察。同时，将组织切成芝麻大小的块，用戊二醛固定，切成纳米薄片并通过TEM（Nikon）观察。

2.8 关键蛋白的确认

（此小节内容原文为空）

2.9 分子对接

靶蛋白结合口袋的筛选：从Alphafold数据库获取蛋白质3D结构文件（鼠源），包括AQP4（Uniprot:P55088）、CLDN18（Uniprot:P56857）、CD300LF（Uniprot:Q6SJQ7）、APOBR（Uniprot:Q8VBT6）、MRC1（Uniprot:Q61830）、AGER（Uniprot:Q62151），并通过CB-Dock2进行结合口袋筛选以确定五个可能网格盒的信息。采用两种对接方法进行IR780-蛋白质复合物的分子对接。通过Autodock vina进行分子对接：使用Autodock Tools 1.5.7完成受体和配体的准备，包括能量优化、赋予分子原子Gasteiger电荷、融合非极性氢原子等，然后使用Autodock Vina 1.2.3进行IR780与每个蛋白质五个网格盒的分子对接，并将具有最低评估值的网格盒确认为最佳配置。通过Ledock进行分子对接：IR780在MMF94力场优化后保存为mol2文件。通过lepro对蛋白质进行水处理。使用Ledock进行IR780与每个蛋白质五个网格盒的分子对接，并记录每个结合口袋的相应最佳配置。

分子动力学模拟：应用GROMACS（版本2018）对受体-配体对接复合物进行分子动力学模拟。蛋白质拓扑文件由AMBER99SB-ILDN力场生成，而配体拓扑文件由使用Amber力场的ACPYPE脚本生成。分子动力学模拟在充满TIP3水分子的周期性包络条件下的方形网格盒中进行。采用NaCl反离子中和系统。应用最陡下降算法最小化管理集的能量，库仑力截断和范德华半径截断均为1.4 nm。通过运行NVT（正则系综）和NPT（等压等温）100 ps达到平衡。LINCS应用于所有结合约束。采用粒子网格Ewald方法进行远程静电处理。在310 K和1.0 bar的周期性边界条件下，对每个系统进行50 ns的模拟。

计算蛋白质-配体复合物的结合自由能量是验证分子相互作用强度的一种方法，有助于深入理解对整体稳定性有贡献的各种化学能的相对重要性。使用Gromacs中的g_mmpbsa工具模拟和计算结合亲和力。

通常，溶剂中蛋白质-配体复合物结合自由能量的计算遵循以下方程：

ΔG_bind = G_complex - (G_receptor + G_ligand)

其中G_receptor和G_ligand代表溶剂中分离的蛋白质和配体的总自由能。

G_complex代表蛋白质-配体复合物的总自由能。此外，每个实体的自由能可以用以下方程表示：

G_X = E_MM - TS + G_solvation

这里，X代表蛋白质、配体或蛋白质-配体复合物。E_MM定义为真空中的平均分子力学势能。TS代表真空中自由能的熵贡献，其中T和S分别代表温度和熵。G_solvation代表溶剂化自由能。

分子力学势能是一种真空势能，包括键合和非键合相互作用，基于分子力学力场参数计算，如方程所示：

E_MM = E_bonded + E_non-bonded = E_bonded + E_elec + E_vdW

这里，E_bonded代表由二面角、角度和不适当相互作用构成的粘附相互作用。非键合相互作用（E_non-bonded）包括静电（E_elec）和范德华相互作用（E_vdW），分别通过库仑波函数和Leonard-Jones势函数模拟。ΔE_bonded通常被认为是零。

溶剂化自由能定义为将溶质从真空转移到溶剂所需的能量。MM-PBSA方法（分子力学泊松-玻尔兹曼表面积）中溶剂化自由能的计算根据以下溶剂化模型进行：

2.10 G_solvation = G_PB + G_SA

G_PB和G_SA代表对溶剂化自由能的静电/非静电贡献。静电项G_pola通过泊松-玻尔兹曼方程计算，而G_SA根据溶剂可及表面积（SASA）计算。同时，进行了与每个残基能量分解相关的研究，这有助于评估蛋白质-配体复合物的MM-PBSA结合能。

2.11 表面等离子体共振

将AGER蛋白（小鼠，HEK293，His，MedChemExpress）、CD300LF蛋白（小鼠，HEK293，Fc，MedChemExpress）、MRC1（小鼠，His标签，ACRO）和AQP4蛋白（人，His-SUMO，MedChemExpress）作为配体偶联到CM5芯片上的葡聚糖残基。样品通过Biacore 8K/2234033检测14个循环，数据以10 Hz的速率收集。基线通过注射缓冲液在第一阶段获得。在第二阶段，注射分析物（IR780溶液）以收集配体-分析物结合信号。在第三阶段，再次注射缓冲液以获取解离信号。

2.12 巨噬细胞清除和流线化运输理论

巨噬细胞清除试剂（氯膦酸盐脂质体和对照脂质体/PBS）购自Liposoma Technology（CP005005）。将C57BL/6N雄性小鼠随机分为两组，包括巨噬细胞清除组（n = 3）和对照组（n = 3）。通过尾静脉注射（150 μL）和气管内滴注（50 μL）用相应的脂质体处理小鼠。1.5天后，通过尾静脉给小鼠注射L-HLNP@IR780（200 μL），并在3小时和6小时后处死。收集器官（肺、肝和脾）制备冰冻切片和单细胞悬液（方案可参考上文方法）。冰冻切片固定并用DAPI染色，在LSCM下观察。单细胞悬液用CD45和CD11B/F4-80标记以识别淋巴细胞和巨噬细胞，并通过流式细胞术检测。

2.13 统计分析

使用均值和SEM（均值的标准误差）来描述荧光信号、细胞活力、尺寸、Zeta电位等方面的差异。均值用于呈现分子动力学模拟（MDS）分析中的数据。使用多重t检验和Student's t检验计算组间差异的显著性，并应用线性回归绘制加载率的拟合曲线。当p < .05时，认为差异具有统计学意义。所有分析均在Graphpad 9.0上进行。

3 结果与讨论

3.1 纳米颗粒表面的IR780碘化物保证了肺靶向现象

负载吡非尼酮形成DLD-HLNP/P@IR780纳米颗粒用于治疗IPF。DLD-HLNP/P@IR780呈现壳核球形，平均尺寸为189.8 nm，其形态与DLD-HLNP@IR780纳米颗粒相似。为了验证分子结构的决定性作用，使用IR780碘化物的类似物分子（包括IR676、IR775和IR783）测试其体内生物分布。在所有四种游离分子中，IR780表现出最佳的肺靶向能力，具有最高的肺/肝荧光比率。采用四种纳米制剂探索IR780负载模式对肺靶向能力的作用，这些制剂分别为DLD@IR780（bis-MPA超支化PEG10k-OH, IR780碘化物）、DLD-HLNP@IR780（bis-MPA超支化PEG10k-OH, DSPC, 胆固醇, DMG-PEG2000, Dlin-MC3-DMA, IR780碘化物）、PFH-HLNP@IR780（PFH-16-OH, DSPC, 胆固醇, DMG-PEG2000, Dlin-MC3-DMA, IR780碘化物）和LNP@IR780（DSPC, 胆固醇, DMG-PEG2000, Dlin-MC3-DMA, IR780碘化物）。当IR780碘化物被包裹在LNP@IR780纳米颗粒的脂质双层中时，纳米载体失去了肺靶向性。具有表面固定IR780碘化物的纳米颗粒（DLD@IR780, DLD-HLNP@IR780, 和 PFH-HLNP@IR780）表现出肺靶向能力，其中DLD-HLNP@IR780纳米颗粒显示出最高的肺/肝比率，大约在20到30之间。相应地，IR780碘化物的类似物也以相同的脂质配方固定在纳米颗粒表面，分别命名为DLD-HLNP@IR783、DLD-HLNP@IR775和DLD-HLNP@IR676，体内结果显示它们均未显示出可比的肺靶向能力。为了进一步可视化靶向过程，在不同时间点离体和体内监测DLD-HLNP@IR780的荧光信号，结果表明纳米颗粒在1小时时平均分布在主要器官中，并在2.5小时时迅速在肺部积累，肺/肝比率从低于5增加到近20。比率峰值30出现在48小时，并在264小时逐渐下降至检测不到的值。这些结果证实了IR780碘化物的分子结构和表面固定模式对于DLD-HLNP@IR780纳米颗粒的肺靶向行为都是必要的。

3.2 DLD-HLNP@IR780到达肺实质的途径

为了精确定位DLD-HLNP@IR780在体内的位置，给小鼠静脉注射DLD-HLNP@IR780或生理盐水（对照），并在不同时间点处死。收集肝、肺和脾，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和TEM观察。DLD-HLNP@IR780在肺部的积累呈时间依赖性，荧光信号从血管扩展到附近组织。相反，肝和脾中的荧光从0.5小时增加到2小时，并在4小时迅速减少，且未观察到随时间延长而扩散的趋势。肺和肝/脾之间两种不同的积累模式引发了一个问题：为什么DLD-HLNP@IR780纳米颗粒在循环到肺内皮时能够快速转运到内部，而在循环到肝/脾血窦时却被限制而没有进一步渗透？在靶向早期，肺、肝和脾中的荧光都显示出由循环中高浓度DLD-HLNP@IR780发射的相似强度的集中信号，表明RES器官有公平的机会捕获DLD-HLNP@IR780。随着时间延长，纳米颗粒无法保留在肝或脾中，而是继续循环到肺部并被捕获，导致脾或肝中的荧光强度下降，而肺中的信号强度上升。此外，DLD-HLNP@IR780在肺中的信号显示出从点状集中分布到平均分散分布的扩散模式，表明DLD-HLNP@IR780的积累是在肺实质中，而不是局限于内皮内。

利用TEM探索DLD-HLNP@IR780纳米颗粒是否穿越肺ECB；在照片中，观察到纳米颗粒（用数字标记）穿越ECB并大量积聚在肺实质中。具体来说，在0.5小时肺的照片中，纳米颗粒16号在从毛细血管腔穿透进入内皮细胞的过程中被捕获，11号位于内皮细胞的细胞质中，而12-15号已经完成穿透并进入上皮细胞。在4小时也观察了肝和脾的组织。在肺实质中发现大量纳米颗粒，而肝/脾血窦中只有极少数纳米颗粒被细胞内化，并且纳米颗粒没有进一步移动到肝细胞或白髓中。相应的体内荧光成像结果、CLSM中组织的概览以及更详细的TEM观察结果与CLSM结果一致，表明在肝或脾血窦中捕获的DLD-HLNP@IR780数量在某种程度上被严格限制向实质内转运。因此，我们提出了另一个假设：IR780碘化物对肺内皮的高亲和力促进了DLD-HLNP@IR780的肺部特异性积累。

3.3 尺寸和表面电荷对生物分布的影响

尺寸和表面电荷是影响纳米颗粒生物分布的两个因素；它们被考虑对DLD-HLNP@IR780纳米颗粒生物分布的影响。先前报道的永久带负电荷的脂质DSPA（18PA）作为一种SORT分子，通过改变LNPs的表面电位来调节其向脾脏的生物分布。将DSPA以及其他永久带负电荷的脂质（DOPA和DMPA）和永久带正电荷的脂质DDAB添加到DLD-HLNP@IR780中，形成具有负或正表面电荷的新纳米颗粒。通过体内荧光成像检测纳米颗粒的生物分布，所有类型的纳米颗粒都表现出强大的肺部积累。相应的颗粒尺寸也进行了测量。纳米颗粒尺寸范围在100到300 nm之间。与中性DLD-HLNP@IR780纳米颗粒的肺/肝比率相比，表面电荷的变化或颗粒尺寸的扩大均未引起纳米颗粒生物分布的显著变化。在排除了表面电荷和颗粒尺寸对DLD-HLNP@IR780生物分布的影响后，DLD-HLNP@IR780的肺靶向行为被确认为一个主动靶向过程；IR780碘化物对肺内皮的高亲和力在很大程度上促成了这一过程。

3.4 IR780碘化物对CD300LF和MRC1具有高亲和力

为了探索与IR780碘化物相互作用并导致特异性生物分布的肺部成分，我们基于内皮细胞中的基因和肺中高丰度基因的交集部分进行了筛选程序。筛选出的26个基因的相应蛋白质根据特定的排除标准进行了进一步筛选，包括蛋白质定位、组织特异性和表达水平。四种蛋白质，包括MRC1、AGER、AQP4和CD300LF被选中进行进一步分析。

MRC1（甘露糖受体C型1），也称为CD206，是一种膜蛋白，在肺巨噬细胞中特异性高