STEAP2胞质氧化还原酶域中NADPH氧化还原态的结构与光谱解析及其电子传递机制研究

《Journal of Biomechanics》：Structural and Spectroscopic Resolution of the NADPH Redox State in the STEAP2 Cytosolic Oxidoreductase Domain

本研究针对STEAP家族金属还原酶中NADPH氧化还原态的结构学争议，通过单晶光谱技术结合高分辨率晶体结构解析，首次证实STEAP2氧化还原酶域(OxRD)与NADPH的结合模式，揭示了X射线诱导的NADP+还原现象，并提出结构域重取向介导的FADH2装载机制，为理解STEAP介导的电子传递路径提供关键实验依据。

　　

在细胞生命活动中，维持铁和铜等金属离子的稳态至关重要，这些金属离子作为辅因子参与众多酶促反应和代谢通路。六次跨膜前列腺上皮抗原（STEAP）家族膜蛋白作为金属还原酶，在铁铜稳态、氧化还原平衡和细胞增殖中发挥核心作用。它们通过依赖FAD和血红素的途径，将电子从胞质NADPH传递至细胞外的三价铁离子（Fe³⁺）和二价铜离子（Cu²⁺），分别将其还原为亚铁离子（Fe²⁺）和亚铜离子（Cu¹⁺），从而促进金属离子的摄取和利用。STEAP2、3和4均含有N端胞质氧化还原酶域（OxRD），该结构域作为NADPH结合位点，是电子传递链的起点。然而，STEAP1却缺乏这一关键结构域，表明其电子输入机制存在差异。

近年来，结构生物学技术的进步使得STEAP蛋白的整体架构逐渐清晰。冷冻电镜（cryoEM）结构揭示了STEAP2和4的三聚体寡聚状态，其中一個亚基的胞质OxRD位于相邻亚基的跨膜域（TMD）下方，形成功能性的电子传输单元。尽管这些结构研究取得了重要进展，但一个关键问题始终悬而未决：结合态烟酰胺辅因子的确切氧化还原状态在结构数据中仍然模糊不清。由于烟酰胺环的电子密度解析存在固有模糊性，且X射线或电子束在数据收集过程中可能诱导还原反应，此前研究中对NADPH（还原型）与NADP⁺（氧化型）的区分一直缺乏直接实验证据。这种不确定性限制了对STEAP催化循环和电子传递机制的全面理解。

为了填补这一空白，研究人员聚焦于STEAP2的OxRD，致力于通过结合高分辨率晶体学和单晶光谱学方法，直接验证结合辅因子的氧化还原状态，从而为STEAP的电子传递机制提供首个明确的结构生物学证据。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1）蛋白质结晶与配体浸泡：获得STEAP2 OxRD晶体后，分别用NADPH或NADP⁺进行浸泡处理；2）单晶紫外-可见光谱技术：在X射线曝光前及数据收集后立即对同一晶体进行光谱采集，直接测定晶体中配体的氧化还原状态；3）X射线晶体学衍射数据收集：在美国斯坦福同步辐射光源（SSRL）完成高分辨率数据采集；4）分子置换与结构精修：以冷冻电镜结构为搜索模型，通过迭代建模获得精确原子坐标；5）结构比较与构象分析：将新解晶体结构与已有冷冻电镜结构进行比对，识别关键构象差异。

光谱测定确定配体结合STEAP2 OxRD的氧化还原状态

通过溶液态紫外-可见光谱分析，研究人员首先确认了游离NADPH在340 nm处有特征吸收峰，而NADP⁺在该区域无吸收。STEAP2 OxRD本身在300-450 nm范围内几乎无吸收。当与NADPH混合后，复合物在350 nm处出现吸收峰，而与NADP⁺混合则无此信号。更重要的是，对NADPH结合的STEAP2单晶进行光谱测定，发现了与溶液态近乎相同的光谱特征，吸收峰位于350 nm，明确证实晶体中结合的是NADPH。相反，NADP⁺浸泡的晶体在X射线曝光前该区域无吸收，曝光后则出现350 nm吸收峰，表明X射线诱导了NADP⁺的还原。这一发现揭示了此前结构研究中氧化状态判读可能存在误差。

NADPH结合STEAP2 OxRD的整体结构

晶体属于原始六方晶系空间群P3₁21，不对称单元包含一个蛋白单体。结构呈现典型的NADPH结合罗斯曼折叠（Rossmann fold），由8个β-折叠和8个α-螺旋组成。在蛋白中间的裂隙中发现了明确的电子密度，结合光谱数据确认为NADPH分子。

STEAP2与NADPH的相互作用

NADPH与STEAP2之间形成了广泛的氢键网络。2′-磷酸基与Ser38、Ser60和Arg61形成直接相互作用，Arg61的胍基与腺嘌呤环发生π-堆叠。核糖环和焦磷酸连接主要通过水分子与蛋白间接作用。烟酰胺环与Phe41堆叠，其羰基氧与Ala151主链酰胺氮形成氢键。参与相互作用的残基在STEAP家族中高度保守，表明这些结合模式具有普遍性。

与STEAP2冷冻电镜结构的比较

尽管晶体结构与冷冻电镜结构整体叠合良好（Cα原子RMSD为0.63 ?），但存在显著局部差异。冷冻电镜结构中NADP⁺的腺嘌呤核苷酸呈现翻转构象，且所有已发表的STEAP蛋白结构中都观察到类似翻转。更重要的是，在α6和β7之间的环区（靠近FAD/FADH₂的异咯嗪环）存在明显构象差异：在冷冻电镜结构中，Asp160与异咯嗪环相互作用并由Arg163稳定，Trp152与FAD/FADH₂的腺嘌呤环π-堆叠；而在晶体结构中，Asp160远离FAD/FADH₂且未被Arg163稳定，Trp152呈垂直取向。晶体堆积分析表明这些差异并非由晶体接触引起，而是反映了内在的生物学相关构象变化。进一步以C端α8螺旋（197-206残基）为参考进行叠合，发现了OxRD相对于TMD的全局性域重取向，提示该构象转变可能介导了FADH₂装载和FAD释放的催化过程。

本研究通过结构生物学与光谱技术的创新结合，解决了STEAP结构生物学中的一个关键模糊问题——首次直接实验验证了STEAP2 OxRD中NADPH的结合及其氧化还原状态。研究发现不仅纠正了此前关于NADP⁺结合的错误认知，揭示了X射线诱导还原的实验假象，更重要的是通过比较结构分析提出了全新的机制模型：OxRD与TMD之间的结构域重取向可能通过调节FAD结合环的构象，促进FADH₂的装载和FAD的释放，从而驱动电子传递过程。

这些发现对理解STEAP家族在金属稳态和氧化应激调节中的功能机制具有重要意义，特别是为前列腺癌等疾病中STEAP蛋白异常表达的治疗策略提供了分子基础。研究强调了对氧化还原酶进行实验性氧化状态验证在结构研究中的必要性，为未来研究其他氧化还原酶系统建立了重要方法论标准。该工作最终发表于《Journal of Biomechanics》，为生物力学领域的酶机制研究提供了范例。