9MW2821抗体-药物偶联物与nectin-4结合的结构基础及其免疫调节功能研究

《Journal of Biomechanics》：Structural basis of nectin-4 recognition by the antibody–drug conjugate 9MW2821

本研究针对nectin-4高表达于多种实体瘤但靶向治疗分子机制不清的问题，通过单颗粒冷冻电镜技术解析了9MW2821 Fab与nectin-4 D1结构域的复合物结构（3.26?），发现抗体通过重链三个CDR环和轻链两个CDR环结合nectin-4前端β折叠片，关键残基Q77/E78/H83/E95参与相互作用。研究首次揭示9MW2821可阻断nectin-4同源二聚化及与TIGIT/nectin-1结合，并通过增强NK细胞CD107a脱颗粒和IFN-γ释放提升抗肿瘤免疫，为优化nectin-4靶向疗法提供了结构依据。

　　

在肿瘤生物学领域，细胞粘附分子nectin-4（也称为PVRL4）因其在胚胎发育期特异性表达、成年后表达降低，却在膀胱癌、肺癌、乳腺癌等多种实体瘤中异常高表达的特性，已成为肿瘤靶向治疗的热门靶点。这种钙离子非依赖性的免疫球蛋白超家族（IgSF）成员，不仅通过激活PI3K/Akt通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，更被发现是免疫检查点分子TIGIT（T-cell immunoglobulin and ITIM domain）的新型配体，在肿瘤微环境中参与免疫抑制调节。然而，尽管全球首个靶向nectin-4的抗体-药物偶联物enfortumab vedotin（EV）已获批用于尿路上皮癌治疗，但抗体与nectin-4在分子水平的相互作用机制，以及其潜在的免疫调节功能仍不清楚。

为了解决这些关键问题，江苏迈威康健康医药研发有限公司的彭方、游梦等研究团队在《Journal of Biomechanics》上发表了重要研究成果。他们通过综合运用结构生物学、生物化学和细胞功能实验，首次解析了临床阶段抗nectin-4 ADC药物9MW2821的抗原结合片段（Fab）与nectin-4的复合物结构，并深入探究了其阻断nectin-4同源/异源二聚化及增强自然杀伤（NK）细胞活性的分子机制。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：利用表面等离子共振（SPR）技术测定9MW2821及其单克隆抗体（mAb）与nectin-4的结合亲和力；通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）在3.26?分辨率下解析9MW2821 Fab与nectin-4胞外域复合物的三维结构；采用丙氨酸扫描和点突变结合SPR分析鉴定关键结合残基；通过分子对接模拟nectin-4与TIGIT、nectin-1的相互作用模式；使用流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估抗体对蛋白质相互作用的阻断效果；利用人外周血单核细胞（PBMCs）与肿瘤细胞共培养系统，分析抗体对NK细胞活化标志物CD107a和IFN-γ表达的影响。

Nectin-4 binding for 9MW2821 and 9MW2821 mAb

研究人员首先通过SPR技术评估了9MW2821及其单克隆抗体与nectin-4胞外域的亲和力，结果显示两者均表现出高亲和力结合，解离常数（K_D）值分别为2.96±0.025 nM和2.80±0.006 nM。ELISA和细胞结合实验进一步证实了这种高亲和力特性，且9MW2821与已上市药物EV竞争性结合nectin-4的相同表位，表明两者具有重叠的结合区域。

Overall structure of the nectin-4/9MW2821 Fab complex

通过冷冻电镜解析的复合物结构显示，9MW2821 Fab主要与nectin-4的膜远端IgV样D1结构域结合，而D2和D3结构域由于柔性较高未能被解析。结构分析表明，nectin-4 D1采用经典的IgV型β-三明治拓扑结构，9MW2821通过重链的三个互补决定区（CDR）环（CDRH1、CDRH2、CDRH3）和轻链的两个CDR环（CDRL1、CDRL3）结合于nectin-4 D1的前端β折叠片（由C、C'、C''、F、G链构成）。与未结合抗体时的nectin-4结构相比，结合过程中nectin-4构象未发生明显变化。

Interactions between nectin-4 D1 and 9MW2821 Fab

详细的界面分析揭示了复杂的相互作用网络：nectin-4的16个残基（表位）与9MW2821 Fab的14个残基（ paratope）在4.0?距离内形成接触。相互作用包括9个氢键、1个盐桥和广泛的范德华力。特别值得注意的是，nectin-4残基Q77、E78、H83和E95在结合中发挥关键作用：Q77与轻链T100形成三个氢键；E78与重链Y59形成两个氢键；H83与重链D32同时形成盐桥和氢键；E95与轻链N31和Y38形成两个氢键。这些相互作用导致结合界面埋藏面积超过1600?²。

Alanine scanning

计算机丙氨酸扫描分析预测，将Q77、E78、H83和E95突变为丙氨酸会导致复合物稳定性显著降低（ΔΔG_mut > 1 kcal/mol），突变自由能变化排序为E78（1.88 kcal/mol）> Q77（1.29 kcal/mol）> H83（1.26 kcal/mol）> E95（1.07 kcal/mol）。

Affinity analysis of 9MW2821 mAb to nectin-4 mutants

实验验证进一步证实了这些残基的重要性。SPR结合动力学分析显示，与野生型nectin-4相比，Q77A和E78A突变体的结合亲和力分别降低8.7倍和7.1倍，而H83A和E95A突变体的亲和力降低更为显著（分别降低33.9倍和32.0倍）。这种亲和力降低主要源于解离速率（k_off）的显著增加，表明H83和E95在稳定复合物构象中发挥更为关键的作用。

Binding analysis of nectin-4 to TIGIT and nectin-1

通过分子对接模拟nectin-4与TIGIT、nectin-1的相互作用模式，发现这些相互作用均涉及nectin-4 D1前端β折叠片的“锁-钥”结合基序。结构比对显示，9MW2821 Fab的结合会通过重链的空间位阻效应，竞争性抑制nectin-4与TIGIT、nectin-1以及自身二聚化的相互作用。

Competitive binding of 9MW2821 mAb against nectin-4 to TIGIT and nectin-1

ELISA和细胞实验证实，9MW2821单克隆抗体能够有效阻断nectin-4与TIGIT（IC₅₀=83 nM）和nectin-1（IC₅₀=108 nM）的结合。流式细胞术分析显示，9MW2821处理可显著降低TIGIT和nectin-1与表达nectin-4的PC-3细胞表面的结合信号。

9MW2821 mAb enhances NK cell cytotoxicity

最令人瞩目的发现是9MW2821的免疫调节功能。通过PBMCs（包含TIGIT⁺ NK细胞）与PC-3-Nectin-4肿瘤细胞共培养实验，研究人员发现9MW2821 Fab（排除ADCC效应干扰）可显著增强NK细胞的活化：与同型对照Fab相比，9MW2821 Fab处理使IFN-γ⁺ NK细胞比例从10.2%±0.3%增加至16.2%±0.3%，CD107a⁺ NK细胞比例从45.2%±2.0%增加至60.6%±0.6%。这表明通过阻断nectin-4-TIGIT免疫抑制轴，9MW2821能够解除NK细胞的功能抑制，增强其抗肿瘤活性。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次揭示了临床阶段抗nectin-4抗体9MW2821与靶点结合的精确分子机制，不仅阐明了其通过关键残基Q77、E78、H83和E95高亲和力结合nectin-4 D1结构域的结构基础，还发现了其双重作用机制：一方面作为ADC药物靶向递送细胞毒性载荷MMAE（monomethyl auristatin E）；另一方面通过阻断nectin-4与TIGIT的相互作用，解除NK细胞的免疫抑制状态，增强抗肿瘤免疫应答。这种双机制作用为理解nectin-4靶向治疗的全面生物学效应提供了新视角，也为优化针对这一重要肿瘤靶点的治疗策略提供了结构依据和理论支持。该研究的发现不仅对9MW2821的后续临床开发具有指导意义，也为广泛意义上的nectin-4靶向药物设计提供了重要参考。