胚胎干细胞来源的细胞外囊泡通过抑制氧化应激延缓细胞衰老的机制研究

《Journal of Biomechanics》：Embryonic stem cell-derived extracellular vesicles delay cellular senescence by inhibiting oxidative stress

本研究揭示了胚胎干细胞（ESC）来源的细胞外囊泡（EVs）通过纤维连接蛋白（fibronectin）-整合素（integrin）-FAK-AKT-GSK3β-Nrf2信号通路，抑制活性氧（ROS）积累，从而延缓成纤维细胞和星形胶质细胞衰老的新机制。该发现为开发基于EVs的抗衰老策略提供了重要理论依据。

　　

随着全球人口老龄化趋势加剧，衰老及相关疾病已成为严峻的社会健康挑战。在细胞层面，衰老表现为细胞不可逆地退出细胞周期，即细胞衰老。衰老细胞的积累会分泌一系列炎性因子（衰老相关分泌表型，SASP），促进局部纤维化和炎症微环境形成，从而加速组织功能衰退，并增加癌症、阿尔茨海默病、心血管疾病等年龄相关疾病的发病风险。因此，探寻能够有效延缓甚至逆转细胞衰老的策略，对于促进健康老龄化和防治衰老相关疾病具有重大意义。

在众多细胞类型中，胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）因其强大的自我更新能力和多能性而备受关注。值得注意的是，ESCs本身几乎不发生衰老，这提示其可能拥有独特的抗衰老机制。近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的关键媒介，在再生医学领域展现出巨大潜力。干细胞来源的EVs已被证明具有促进组织修复、减轻纤维化等再生能力，甚至年轻个体血浆中的EVs也能使衰老组织恢复活力。然而，ESC来源的EVs（ESC-EVs）延缓细胞衰老的具体分子机制尚不明确，这限制了其向临床应用转化的进程。

为了阐明ESC-EVs的抗衰老机制，来自康奈尔大学分子医学系的研究团队在《Journal of Biomechanics》上发表了一项重要研究。研究人员发现，ESC-EVs能够有效延缓小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和星形胶质细胞在连续传代过程中诱导的复制性衰老。更重要的是，他们首次完整地揭示了一条从EVs表面蛋白到细胞内抗氧化应激的关键信号通路。

为开展此项研究，研究人员运用了几项关键技术方法：利用纳米颗粒追踪分析（NTA）和负染电子显微镜对ESC释放的EVs（包括微囊泡MVs和外泌体exosomes）进行定性和定量分析；通过超速离心结合尺寸过滤法分离和纯化MVs与exosomes；采用Western blot技术检测关键信号蛋白（如p-FAK, p-AKT, p-GSK3β, Nrf2）的磷酸化水平和表达变化；通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老状态；使用MitoSOX Red荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平；并利用特异性抑制剂（如AKT抑制剂MK-2206、FAK抑制剂III、GSK3β抑制剂CHIR99021）和RGD肽进行功能丧失性实验，以验证信号通路中各环节的必要性。研究所用细胞包括E14tg2a.4小鼠ESC、原代MEFs以及从C57BL/6小鼠分离的星形胶质细胞。

ESCs产生大量MVs和外泌体并可转移至成纤维细胞

研究人员首先证实了多能性ESCs（高表达Oct3/4, Nanog, SOX2，具有强大的类胚体形成能力和碱性磷酸酶活性）相较于MEFs，对复制性 exhaustion诱导的衰老具有显著抵抗力。通过NTA和电镜分析，他们发现ESCs条件培养基中含有大量大小在70-500 nm范围内的EVs，其中外泌体（<220 nm）的数量约为微囊泡（>220 nm）的两倍。Western blot结果显示，分离的MVs富含Hsp90和VDAC标志物，而exosomes则富含CD81和LAMP1标志物。利用膜染料FM 1-43X标记EVs的实验证明，这些EVs能够有效地与MEFs结合。

EVs衍生于ESCs延缓细胞衰老

核心实验发现，在连续传代培养过程中，定期用ESC-EVs处理的MEFs和星形胶质细胞，其增殖能力（通过群体倍增水平PDL评估）得以维持，而未经处理的对照组细胞则生长停滞。SA-β-gal染色阳性细胞比例在EVs处理组中显著降低。同时，EVs处理还维持了衰老负调控因子SIRT1和NAMPT的表达水平，而这两种蛋白在衰老细胞中表达会下调。重要的是，EVs处理并未改变MEFs的Thy1标志物或星形胶质细胞的GFAP标志物表达，表明其延缓衰老的作用并非通过诱导细胞去分化实现。

EVs衍生于ESCs通过激活AKT延缓成纤维细胞衰老

机制探索表明，ESC-EVs处理能快速诱导MEFs中AKT在Thr308和Ser473位点的磷酸化（即激活）。使用AKT特异性抑制剂MK-2206可完全阻断EVs带来的生长优势、衰老延缓效应以及SIRT1/NAMPT表达的维持，证明AKT的激活在此过程中不可或缺。

纤维连接蛋白包被于ESCs来源的EVs表面并对激活受体细胞中的FAK和AKT至关重要

进一步研究发现，ESC-EVs表面包被着细胞外基质蛋白纤维连接蛋白（fibronectin）。当EVs上的fibronectin与MEFs表面的整合素（integrin）结合后，触发了FAK在Tyr397位点的磷酸化。用胰蛋白酶去除EVs表面的fibronectin，或使用RGD肽竞争性抑制integrin与fibronectin的结合，均能削弱EVs诱导的AKT磷酸化，说明fibronectin-integrin相互作用是启动下游信号的关键。

EV诱导的FAK激活延缓成纤维细胞衰老

使用FAK抑制剂III处理，不仅抑制了FAK的自身磷酸化，也阻断了EVs诱导的AKT磷酸化。更重要的是，FAK活性的抑制同样逆转了EVs在延缓细胞衰老和维持SIRT1/NAMPT表达方面的积极作用，确立了FAK在fibronectin-integrin下游信号传导中的核心地位。

EV刺激的AKT活性抑制GSK3β活性及衰老诱导

AKT的一个重要下游靶点是糖原合成酶激酶3β（GSK3β）。研究发现，ESC-EVs处理能促进GSK3β在Ser9位点的磷酸化，从而抑制其激酶活性。这种磷酸化可被AKT抑制剂、RGD肽或FAK抑制剂所阻断。直接使用GSK3β抑制剂CHIR99021处理MEFs，足以模拟EVs的效果，即延缓细胞衰老并维持SIRT1/NAMPT表达，表明抑制GSK3β是EVs抗衰老作用中的一个关键环节。

EVs来自ESCs上调Nrf2表达以抑制受体细胞中的ROS水平

被抑制的GSK3β会减少其底物蛋白的降解。研究人员发现，ESC-EVs处理能快速上调转录因子Nrf2（核因子E2相关因子2）的蛋白水平，而对c-Myc无明显影响。Nrf2是细胞抗氧化反应的主调控因子。功能上，EVs处理显著降低了MEFs中线粒体超氧化物（ROS）的水平，此效应依赖于AKT的激活。同样，GSK3β抑制剂处理也能降低ROS水平。这表明，ESC-EVs通过fibronectin-integrin-FAK-AKT通路抑制GSK3β，稳定Nrf2，进而增强细胞的抗氧化能力，减少ROS积累，最终延缓衰老。

综上所述，本研究清晰地描绘了一条ESC-EVs延缓细胞衰老的分子通路：ESC-EVs表面的fibronectin与靶细胞整合素结合，激活FAK和AKT；活化的AKT磷酸化并抑制GSK3β活性，导致转录因子Nrf2稳定性增加；Nrf2进而启动抗氧化基因表达，清除过量ROS，从而阻止细胞走向衰老。

在讨论部分，作者强调了该研究的创新性和重要意义。尽管此前有研究提示干细胞或年轻个体来源的EVs具有抗衰老潜力，但其精确机制多属未知。本研究首次系统阐明了ESC-EVs通过一条明确的信号通路发挥抗衰老作用。此外，作者指出，单纯添加游离的fibronectin或将其与分化细胞来源的（本身不含fibronectin的）EVs结合，均无法完全模拟ESC-EVs的效果，提示ESC-EVs可能还含有其他未知的活性 cargo（如特定蛋白质、miRNA、脂质等）共同协调作用。关于AKT在衰老中的双重角色（有时促进衰老），作者认为可能与激活程度和持续时间有关，ESC-EVs诱导的适度且受控的AKT激活可能优先导向抗衰老通路。

该研究不仅深化了对干细胞生物学和细胞衰老机制的理解，而且为开发基于EVs的抗衰老治疗策略提供了坚实的理论基础和潜在的分子靶点。未来，探索ESC-EVs在动物模型中对衰老相关表型（如心脏病、神经退行性变）的干预效果，并评估其长期安全性，将是推动该领域向临床迈进的关键步骤。