基于SYBR Green qPCR技术检测凡纳滨对虾透明仔虾病病原——副溶血弧菌方法的开发与应用

《Journal of Invertebrate Pathology》：Development and application of SYBR Green-based qPCR method to detect Vibrio parahaemolyticus causing translucent post-larvae disease in shrimp Litopenaeus vannamei

本研究开发了一种基于SYBR Green的qPCR方法，可特异性检测凡纳滨对虾透明仔虾病（TPD）病原——携带毒力基因vhvp-2的副溶血弧菌（VpTPD）。该方法检测限达4.46×100 copies/μL，具有高灵敏度、强特异性及抗干扰能力，为对虾养殖业大规模筛查和早期防控提供了可靠技术支撑。

　　

研究亮点

仔虾样本制备

实验所用健康凡纳滨对虾（10–12克）购自海南蓝印水产种业科技有限公司。通过1×10⁶ CFU/mL浓度浸泡攻毒后，在达到半数致死剂量（LD₅₀）时采集肝胰腺组织。所取组织立即用液氮速冻，并保存于-80°C超低温冰箱。使用天根海洋动物DNA提取试剂盒（DP324）从上述组织中提取基因组DNA。

引物筛选

根据琼脂糖凝胶电泳结果，初步筛选出12对能够特异性扩增且扩增效率较高的引物组合（图1）。这12对引物包括：针对vhvp-1基因的4组（vhvp-1-F1/vhvp-1-R1、vhvp-1-F4/vhvp-1-R4、vhvp-1-F5/vhvp-1-R5和vhvp-1-F6/vhvp-1-R6）（图1A）；针对vhvp-2基因的4组（vhvp-2-F1/vhvp-2-R1、vhvp-2-F3/vhvp-2-R3、vhvp-2-F4/vhvp-2-R4和vhvp-2-F5/vhvp-2-R5）（图1B）；以及针对vhvp-3基因的4组引物。

讨论

凡纳滨对虾占全球养殖虾产量的50%以上，是全球水产养殖中经济价值最高的物种之一，尤其在中国和东南亚地区。2019年，中国南方对虾育苗场爆发的新型透明仔虾病（TPD）缺乏有效的预防或治疗方法，导致凡纳滨对虾仔虾出现严重短缺，死亡率高达90–100%，严重威胁渔业可持续发展。