基于短读长NGS的卵菌群落表征引物组比较研究及其在环境DNA分析中的应用

《Journal of Microbiological Methods》：Comparison of primer sets for short-read NGS-based characterisation of oomycete communities

本研究针对环境微生物组研究中卵菌常被忽视的问题，系统评估了多种引物组在eDNA样本中表征卵菌群落的效果。研究人员通过单协议eDNA调查发现ITS1/3oo引物组在卵菌丰富度和分类覆盖度方面表现最佳，同时发现EMP的18S rRNA引物在真核生物覆盖广度上优于COI引物。该研究为eDNA群落分析提供了特异性与覆盖度最佳平衡的引物选择方案，对揭示卵菌在自然和管理生态系统中的生态功能具有重要意义。

　　

在微生物研究领域，卵菌（Oomycetes）作为一个关键但常被忽视的类群，扮演着从威胁粮食安全到促进营养循环和生物防治的多样化生态角色。尽管其重要性毋庸置疑，但在环境微生物组研究中，卵菌往往被埋没在更广泛的原核和真核微生物的阴影之下。这种忽视部分源于技术挑战：现有的分子生物学工具，特别是用于环境DNA（eDNA）分析的引物，往往未能充分捕捉卵菌的多样性。因此，开发和应用能够准确、全面表征卵菌群落的引物组，成为深入理解其生态功能和分布的关键。

针对这一挑战，Steven A. Wakelin、Charlotte Armstrong、Syaliny Ganasamurthy、Kathryn Wigley和Celine Mercier等研究人员开展了一项系统研究，比较了多种引物组在短读长下一代测序（NGS）技术中对卵菌群落的表征效果。他们的研究成果发表在《Journal of Microbiological Methods》上，为环境微生物学家提供了重要的方法学参考。

研究人员采用来自 Kunzea robusta（kānuka；桃金娘科）和 Phormium tenax（harakeke；阿福花科）栽培土壤的eDNA样本，通过单协议eDNA调查方法，评估了多个引物组的性能。研究重点关注引物组对卵菌群落的特异性、覆盖度和多样性检测能力。

关键技术方法包括：环境DNA（eDNA）提取技术、多重PCR扩增策略、短读长下一代测序（NGS）技术、生物信息学分析流程（包括ASV划分和分类学注释），以及基于标准参考数据库的引物性能评估体系。所有样本均来源于新西兰基督城Scion研究所生态与环境部门的实验场地。

ABSTRACT

研究通过系统评估发现，ITS1/3oo引物组在评估的引物中表现最佳，在单协议eDNA调查中返回了较高的卵菌丰富度和更广泛的分类覆盖度。研究人员强调，这反映了在其特定实验条件下的性能表现，而非绝对的、普遍最优的引物选择。对于更广泛的真核生物覆盖，地球微生物组计划（EMP）的18S rRNA引物组优于测试的基于COI的引物。尽管这些广覆盖引物组检测到了广泛的卵菌种类，但它们在卵菌特异性覆盖方面的性能不如卵菌靶向引物组。

引物性能比较

研究发现，在专门针对卵菌群落的表征方面，ITS1/3oo引物组展现出显著优势，能够检测到更高数量的扩增子序列变体（ASVs）和更广泛的分类群。这表明该引物组在卵菌特异性研究具有重要价值。

分类多样性分析

通过对 kānuka 和 harakeke 根际土壤样本的分析，研究分别发现了平均52和54个卵菌ASVs，涵盖了 Haptoglossa、Alanopsis、Aphanomyces、Achyla、Pythium、Phytopythium、Globiosporangium、Phytophthora、Myzocytiopsis、Eurychasma 和 Lagendum 等多个进化谱系。这一发现证实了新西兰土壤环境中卵菌群落的高度多样性。

广覆盖引物的表现

研究同时评估了非特异性引物组的性能，发现EMP的18S rRNA引物在真核生物广泛覆盖方面表现优异，但其在卵菌特异性检测方面的灵敏度仍不及专门设计的卵菌靶向引物。

研究结论表明，基于对真实世界样本中一系列卵菌靶向引物的评估，研究人员能够为最大化卵菌检测提供引物组推荐，并为eDNA为基础的群落分析提供特异性和覆盖度的最佳平衡方案。这些引物可用于捕捉自然和管理生态系统中卵菌的多样性和生态角色，从而能够更准确地评估它们对植物健康、土壤和营养动态的影响，同时加深我们对这个未被充分研究的微生物进化枝的多样性和分布的理解。

讨论部分强调了本研究的方法学意义，指出选择合适的引物组对于eDNA研究至关重要。研究人员建议，根据具体研究目标（卵菌特异性检测还是广谱真核生物调查）选择相应的引物策略。研究还指出，虽然ITS1/3oo引物组在当前条件下表现最佳，但引物性能可能随着实验条件、样本类型和测序平台的变化而有所不同，因此建议研究者在实际应用中根据自身条件进行引物验证。

这项研究的重要意义在于为环境微生物学家提供了经过实证的引物选择指南，将有助于推动卵菌生态学研究的标准化和可比性。随着分子生态学技术的不断发展，这种基于方法学比较的研究将为微生物多样性研究提供重要基础，最终促进我们对复杂微生物群落结构和功能的理解。