综述：骨微环境中癌细胞休眠的机制与治疗策略

《Current Osteoporosis Reports》：Cancer Cell Dormancy in the Bone Microenvironment

本综述系统探讨了骨微环境如何通过特殊生态位（如NG2+Nestin+MSCs）和信号通路（TGF-β2/BMP7/AXL-GAS6）诱导并维持癌细胞休眠，揭示了自噬（autophagy）和PERK-UPR等关键生存机制。文章强调靶向休眠细胞（如采用CDK4/6抑制剂或羟氯喹）可防止复发，为乳腺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤的治疗提供新方向。

　　

引言

癌细胞休眠是治愈骨微环境中癌症的主要障碍，涉及多发性骨髓瘤等原发癌及乳腺癌、前列腺癌等转移癌。休眠细胞处于可逆细胞周期停滞状态，能够逃避治疗并在后期重新激活导致疾病复发。骨微环境中的特殊生态位（如骨衬细胞和NG2⁺Nestin⁺间充质干细胞）通过多种信号通路支持休眠的诱导和长期维持。

定义休眠、衰老和静止

癌症休眠可分为肿瘤团块休眠和细胞休眠。细胞休眠指单个细胞处于可逆细胞周期停滞，具有重新激活和肿瘤扩增的能力。休眠细胞与健康静止细胞、衰老细胞具有相似特征（如Ki-67^-、p21⁺、p27⁺），但关键区别在于休眠和静止的细胞周期停滞是可逆的，而衰老状态被认为是永久的。细胞休眠由环境压力触发，是保护机制以在转移生态位中生存。

癌细胞休眠机制

骨微环境包含促休眠生态位，能够触发休眠和重新激活。休眠应被视为动态的"开关"过程，细胞可进入休眠、激活分裂，其后代再次进入休眠。休眠细胞在骨髓中可长期存留（数月到数年），但休眠动态的具体细节尚不清楚。

微环境细胞对休眠的调节

癌细胞休眠由微环境的外部信号控制（图2）。骨髓中有许多不同细胞类型形成特殊生态位，各执行独特任务以贡献于造血、骨维持和其他稳态功能。癌细胞利用这些生态位，促进其持续存在、生存和耐药性。

在骨髓癌（如骨髓瘤和白血病）中，原发部位是骨髓，但这些癌症仍会扩散到多个骨骼部位。在骨转移癌中，播散性肿瘤细胞（DTCs）离开原发肿瘤并通过循环扩散到骨。尽管组织起源不同，但不同癌症类型在骨中的休眠机制有许多相似之处。

骨髓通过通常参与健康造血的化学吸引物招募癌细胞。这包括C-X-C趋化因子配体12（CXCL12）-CXC受体4（CXCR4）趋化因子轴，其在骨髓中招募并保留早期B淋巴细胞、浆细胞和造血干细胞（HSCs）。DTCs到达骨髓时通常参与骨内膜和/或血管周围生态位，可在其中保持休眠状态长时间。

通常，间充质/成骨细胞谱系在不同癌症类型中 consistently 被涉及促进/维持骨微环境中的休眠，尽管是一个还是多个促休眠生态位以及具体细胞类型参与仍是 ongoing 研究领域（图2A）。休眠细胞已被显示位于I型胶原（Col2.3 GFP⁺）、骨桥蛋白和ALCAM表达细胞附近的骨内膜表面，成骨细胞保护癌细胞免受氧化损伤和缺氧。骨衬细胞是异质性细胞群体，促休眠生态位可能是这些细胞的特定亚群，如 pre-B淋巴细胞生态位由AB骨衬细胞（Lin^-CD31^-CD51⁺Sca-1^-PDGFRα⁺PDGFRβ⁺）支持。在乳腺癌中，休眠细胞也紧邻内皮 mucin⁺血管周围生态位，并 specifically 由NG2⁺Nestin⁺间充质基质细胞（MSCs）调节。血管周围生态位对骨髓中的乳腺癌DTCs具有保护作用，提供整合素介导的化疗耐药性，无论它们是休眠（p27⁺）还是循环（p27^-），靶向内皮源性血管性血友病因子和血管细胞粘附分子1（VCAM1）使小鼠对化疗敏感以防止骨转移。最近，显示具有不同起源的骨转移表现出三种不同的免疫生态系统，富含巨噬细胞和破骨细胞、单核细胞或调节性和耗竭性T细胞。休眠生态位尚未研究，但休眠可能受这些独特富集的不同免疫细胞类型影响。

骨生态位产生几种促休眠因子（图2A，C），使生态位参与（如CXCL12）和休眠维持[如生长停滞特异性6（GAS6）、骨形态发生蛋白7（BMP7）、转化生长因子（TGF）-β2、白血病抑制因子（LIF）]。在骨中多种癌症类型中，涉及休眠维持的通路是成骨细胞谱系细胞和乳腺癌细胞表达的GAS6，与TYRO3、AXL或MER（TAM）酪氨酸激酶受体结合，尽管表达的受体类型因癌症类型而异。AXL-Gas6轴在骨髓瘤和前列腺癌细胞休眠中很重要，类似地，MER-GAS6轴在急性淋巴细胞白血病中促进休眠。小鼠中AXL抑制剂治疗减少休眠骨髓瘤细胞比例并增加肿瘤负担，表明破坏AXL-GAS6轴抑制休眠从而触发重新激活。在乳腺癌中，来自NG2⁺/Nestin⁺MSCs的TGF-β2和BMP7维持休眠。实际上，在心脏内注射E0771-GFP乳腺癌细胞前，使用诱导或条件性删除TGF-β2删除小鼠动脉周围NG2⁺细胞，减少p27⁺休眠细胞数量并增加骨转移发生率。虽然这些研究显示破坏骨髓瘤中的AXL或NG2⁺MSC TGF-β2表达可重新激活休眠细胞，但并非所有细胞被唤醒。现在 evident 许多因素涉及促休眠生态位，意味着休眠维持是多因素过程，不完全依赖任何单一促休眠信号。在乳腺癌中，Ren等人鉴定了从小鼠带有PyMT-B01细胞的骨中分离的休眠细胞上调的基因，它们的休眠基因特征与患者更好 outcomes 相关。然而，在乳腺癌细胞中敲低或过表达这些基因（Cfh、Gas6、Mme、Ogn） individually 在植入小鼠时对肿瘤负担没有可测量影响，尽管本研究未报告休眠细胞数量。前列腺癌细胞中的AXL敲除不改变休眠诱导。虽然这可能表明这些基因各是休眠的结果而非原因，但它们也支持休眠依赖生态位，细胞休眠是多因素过程，具有内置冗余的观点。

休眠细胞可通过触发细胞周期重新进入的信号重新激活（图2B）。在骨中，骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌中休眠退出的一个 well-established 机制是通过刺激破骨细胞吸收。这可通过破骨细胞因子受体激活核因子kappa-B配体（RANKL）、去势或卵巢切除术诱导，可用抗吸收剂唑来膦酸或OPG-Fc抑制。最近一项试验证明辅助唑来膦酸减少乳腺癌患者带有DTC阳性骨髓的DTCs。目前，吸收后重新激活的分子机制尚不清楚，但可能是由于从骨基质释放促进细胞周期重新进入的生长因子，或破坏促休眠生态位。微环境源性 interleukin（IL）-1B也通过Wnt signaling 促进小鼠乳腺癌骨转移的发展。有趣的是，肿瘤和微环境源性IL-1B在原发肿瘤中具有相反效果，抗肿瘤免疫细胞浸润损害肿瘤生长。用anakinra抑制IL-1B与唑来膦酸和阿霉素结合时可预防骨转移发展。在乳腺癌中，微转移形成在靠近活性成骨细胞的成骨生态位，癌细胞依赖通过连接蛋白43间隙连接转移钙。因此，促休眠生态位内肿瘤-微环境信号的变化可 initiate 从静止到细胞周期重新进入的切换。

最近发展 identified 衰老微环境促进骨髓瘤进展和增殖。骨髓瘤细胞诱导骨髓脂肪细胞衰老样表型，进而诱导对地塞米松耐药。骨髓瘤 preceded by 恶性前 condition 单克隆丙种球蛋白病（MGUS），每年有1%风险从MGUS进展为骨髓瘤。在具有衰老MSCs的患者中，从MGUS进展为骨髓瘤的风险更高。衰老（β-半乳糖苷酶⁺）骨髓MSCs通过上调衰老因子包括Gremlin-1促进骨髓瘤细胞增殖。虽然微环境细胞的衰老表型促进骨髓瘤进展，但当浆细胞表现衰老表型时，情况可能不同。Borges等人最近显示，来自MGUS和骨髓瘤患者的浆细胞与健康浆细胞相比，基于几个衰老基因列表表现衰老样表型。衰老表型在稳定MGUS患者中高于进展性疾病，与其他研究显示SASP表型通过免疫激活有助于清除和细胞更新一致。一个有趣发现是衰老浆细胞具有旁分泌效应，诱导周围微环境细胞衰老。应注意，衰老特征与休眠癌细胞特征有相当大重叠（如p21⁺、Ki-67^-），休眠基因集 similarly 显示患者生存优势。

外在休眠因素

超越细胞相互作用，肿瘤微环境的外在因素可诱导或调节休眠，包括细胞外基质（ECM）组成、缺氧、营养可用性和治疗剂（图2D）。这些是体外诱导休眠的常见方法，但并非所有这些机制已在体内骨微环境中研究和验证。例如，骨微环境包含复杂ECM。然而，虽然ECM在其他部位控制休眠，整合素对骨转移重要，但尚不清楚骨ECM是否直接调节休眠。

氧水平调节细胞代谢和控制静止与增殖。与正常组织（2%-9%）相比，骨髓中的氧浓度低（缺氧，<1%-6%）。缺氧对健康干细胞静止维持关键，缺氧也支持癌症干细胞和化疗耐药性。在骨髓瘤中，缺氧诱导干细胞样特征，去泛素酶 tripartite motif-containing protein 44（TRIM44）稳定缺氧诱导因子（HIF）1α在体内维持休眠。在乳腺癌中，缺氧在原发部位和DTCs中诱导休眠，细胞即使在缺氧移除后仍保持休眠，然而 prolonged 缺氧下调LIF受体（LIFR）触发休眠逃逸和骨微转移形成（图1D）。

癌症治疗剂 themselves 也可在多种癌症中诱导休眠。在骨髓瘤中，标准护理治疗硼替佐米或美法仑已被 observed 在存活的骨驻留细胞中诱导休眠表型。这些发现突出消除所有癌细胞以确保预防复发的复杂挑战。

内在休眠控制

内在，细胞复制或静止/停滞决策 tightly 由CDKs及其相关细胞周期蛋白 presence 控制（图1）。细胞周期蛋白和CDKs的特定阈值需要通过每个细胞周期限制点以允许细胞周期进入和增殖。具体，增加细胞周期蛋白D增加CDK4/6，磷酸化转录抑制因子Rb并使下游增殖因子表达成为可能。相反，减少CDK活性赋予正常静止和癌症休眠。大量 variety intra-和 extra-细胞信号通路汇聚于CDK调节，以允许响应细胞条件的动态细胞周期控制。细胞周期蛋白D/CDK4/6-Rb蛋白通路对正常和恶性乳腺上皮细胞增殖关键。用FDA批准剂（如abemaciclib、palbociclib和ribociclib）抑制CDK4/6与激素治疗结合，通过防止Rb磷酸化和诱导G1细胞周期停滞，证明有效治疗HR⁺转移性乳腺癌，支持CDK4/6在休眠调节中的作用。无论 stimuli，癌症休眠通路 largely 交汇于p38和ERK调节，分别减少CDKs和促进细胞周期蛋白表达（图1），这种平衡控制休眠维持和释放。维持这种抗增殖信号对 enable 休眠癌细胞长期生存能力 essential。

遗传、表观遗传和转录组改变

遗传异质性在增殖和休眠药物耐受状态中保守，相反休眠决策由表观遗传和转录改变决定。乳腺癌证据显示在 uniform 条件下随机进入和异步退出休眠，加强休眠动态由表观遗传和转录重编程驱动的理论。

表观遗传调节 largely 由组蛋白甲基化和乙酰化控制，决定DNA可及性以控制转录。在乳腺癌中使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）可诱导LIFR和 consequently 促休眠机制。类似地，在前列腺癌中，HDACi通过恢复干扰素信号抑制骨中转移性 outgrowth。HDACi also 批准用于骨髓瘤，但对休眠细胞的影响尚未研究。此外，组蛋白甲基转移酶Smyd5维持乳腺癌休眠，类似地组蛋白甲基化抑制剂5-氮胞苷 facilities 乳腺癌和头颈鳞状细胞癌（HNSCC）维持。5-氮胞苷和全反式维甲酸（ATRA）组合增加核受体亚家族2 Group F成员1（NR2F1）表达，通过SOX9和维甲酸受体（RAR）β在前列腺癌和HNSCC中维持休眠。

骨微环境中的休眠癌细胞表现与增殖对应物相比独特转录组。在骨髓瘤中，单细胞RNA测序揭示休眠细胞（DiDhi，5TGM1小鼠模型）表达更类似于髓系谱系细胞包括单核细胞和巨噬细胞的转录组特征。在前列腺癌骨转移中，休眠细胞（PGH⁺，RM1小鼠模型）富集涉及I型干扰素信号的基因，失去这一特征导致明显骨转移。炎症和免疫特征也在休眠乳腺癌细胞（DiD⁺细胞，PyMT-B01小鼠模型）中富集。因此，虽然不完全相同，但有几个基因和通路在不同癌症类型的休眠细胞中 consistently 改变，包括AXL-GAS6轴。切换这些基因特征的精确机制尚未 fully 阐明，但被认为是微环境诱导，各种 microRNAs 也涉及转录调节和休眠诱导。

信号机制和代谢

促休眠线索最终导致细胞周期停滞的诱导和长期维持。几个通路（如TGF-β2:TGBRIII、BMP7:BMPRII、LIF:LIFR）汇聚于中央休眠-增殖介质，如p38、ERK和STAT3/AKT以 enable 长期休眠生存（图2D）。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）下调已被显示减少ERK信号并通过抑制Src激酶/局部粘附激酶通路驱动休眠维持，体内靶向Src和MEK1/2防止重新激活和转移。然而，至今在治疗 approaches 靶向这些轴用于骨内癌症休眠方面进展甚少。

休眠癌细胞依赖自噬，一种细胞回收功能失调或不必要细胞器和蛋白质的过程。给定休眠可能是响应和生存治疗的路线，自噬可能提供细胞从氧化/代谢压力恢复的机制。靶向自噬，特别是线粒体自噬，用羟氯喹或敲低自噬相关基因7（ATG7）导致功能失调线粒体积累和氧化压力 sufficient 诱导凋亡，突出 novel 治疗途径。类似地，通过增加肿瘤抑制因子 aplasia Ras homolog member I（AHRI）在卵巢癌中诱导自噬促进休眠。虽然这些研究未 specifically 关注骨，自噬可能是一般内在压力响应机制，而非微环境特异性。

胰腺内质网激酶（PERK）也被 identified 作为肿瘤生成和“自发”休眠人表皮样癌HEp3细胞在体外和体内生存的调节因子。虽然PERK显著涉及未折叠蛋白响应（UPR），休眠细胞生存可能通过其在自噬和氧化压力调节中的功能 facilitated。静止细胞经历代谢转变远离葡萄糖依赖性以 favor 氧化磷酸化提升ROS生产，通常由缺氧诱导。主抗氧化转录因子NRF2是PERK的直接靶标。PERK删除导致NRF2失活，导致衰减生长和增加氧化压力。如此，PERK的双重保护作用在休眠癌细胞生存中证明 significant。Calvo等人（2023）最近显示用PERK抑制剂HP40治疗选择性体内耗尽骨髓和肺中HER2⁺乳腺癌DTCs。这 mirrored 使用自发休眠D-HEp3 HNSCC细胞，突出PERK作为休眠细胞特异性毒性的可能 novel 治疗靶标。

靶向骨转移癌中细胞休眠的临床试验

对我们理解休眠生物学的 advancements 导致几种治疗剂在临床试验中的发展或重新部署（表1）。当前消除休眠癌细胞的策略 fall into 三个主要类别：（1）直接靶向休眠细胞，（2）防止重新激活，或（3）诱导重新激活以使它们对靶向增殖细胞的治疗敏感（图3）。后者方法被认为 risky，因为即使一小部分治疗难治性/耐药性增殖细胞可能 potentially 驱动不可治愈复发性疾病。至今，没有NICE或FDA批准的策略直接靶向休眠癌细胞，尽管一些治疗可损害重新激活。

开发靶向休眠细胞治疗的挑战是需要到达每个个体癌细胞，以及异质性。个体骨髓瘤患者不同骨骼部位样本的基因组分析，或美法仑存活克隆中的分析，表明复发可能由单个克隆驱动，因此一个休眠细胞足以 initiate 复发。如此，预期在大多数患者中完全消除休眠细胞可能需要组合治疗。

防止重新激活的治疗

防止休眠细胞重新激活的治疗可通过抑制复发和骨中转移性 outgrowth 延长生存。许多策略在临床前有效并在评估骨转移的试验中显示有希望 results。

CDK4/6抑制剂

在晚期/转移性乳腺癌中，CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）在英国批准用于HR⁺HER2^-乳腺癌， either 在先前未治疗患者或内分泌治疗后，与氟维司群或芳香酶抑制剂组合。PALOMA-2试验显示 palbociclib 加 letrozole 延长低负担骨 only 疾病患者中位无进展生存（mPFS）36.2个月，与 letrozole 单独相比减少疾病进展风险59%。比较，早期乳腺癌的辅助试验显示 only 适度（monarchE、NATALIE试验）或无（PALLAS、PENELOPE-B）生存 outcomes 改善。然而，这些试验导致推荐使用辅助 abemaciclib 与内分泌治疗在高复发风险的HR⁺HER2^-早期乳腺癌中。关于辅助 ribociclib 与芳香酶抑制剂用于HR⁺HER2^-早期乳腺癌的指南即将宣布。CDK4/6i防止骨转移性 outgrowth 的有效性可能通过防止休眠重新激活，尽管尚未临床评估。

CDK4/6i也在前列腺癌临床试验中（表1），但这些未 specifically 评估骨转移设置中的 outcomes。至今，CDK4/6i与其他治疗结合时良好耐受，但临床疗效未 strongly 证据。III期CYCLONE 2试验发现添加 abemaciclib 到 abiraterone 在去势抵抗前列腺癌中无放射照相PFS改善。类似地，II期试验发现在Rb阳性转移性激素敏感性前列腺癌中与雄激素剥夺治疗单独相比无放射照相PFS benefit。其他组合在I/II期调查中，给定在乳腺癌骨转移中的有希望疗效，确定CDK4/6i是否 similarly 有效在前列腺癌骨转移中令人感兴趣。

选择性雌激素受体降解剂

雌激素受体（ER）靶向治疗对治疗ER阳性乳腺癌关键，并用作长期辅助治疗以防止来自休眠DTCs的复发。选择性ER降解剂/下调剂（SERDs）已被开发以克服内分泌耐药性，特别是在ESR1突变乳腺癌中，导致ER组成型激活和标准雌激素治疗（ETs）敏感性减少。SERDs可能通过克服休眠DTCs中的内分泌耐药性防止重新激活。当前，fulvestrant是 only FDA批准SERD，用于ET难治性晚期/转移性乳腺癌。新口服生物可用SERDs（表1）在早期和晚期乳腺癌中显示有希望疗效和耐受性。来自coopERA试验的早期数据显示早期乳腺癌中从基线到第2周Ki-67减少，表明SERDs可能减少肿瘤增殖。Ongoing III期试验评估它们在ER⁺HER2^-早期乳腺癌中的潜力。

5-氮胞苷和ATRA

ATRA和5-氮胞苷在临床前在休眠HNSCC和乳腺癌中显示 promise。这 motivated 一项 ongoing 临床试验与5-氮胞苷和ATRA在生化复发性前列腺癌患者中诱导休眠和防止复发。组合 appears 安全且良好耐受，一小部分患者证明临床活性。

直接靶向休眠癌细胞

直接杀死休眠细胞的治疗如果每个休眠癌细胞被靶向可能最终治愈。一些靶向休眠生物学的 agents 显示有希望 results 临床前，现正在评估骨转移的试验中。

羟氯喹

癌细胞休眠依赖自噬，自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）在临床试验中以防止乳腺癌复发 specifically 通过靶向休眠DTCs（表1）。HCQ在转移性乳腺癌患者中与 palbociclib 安全且耐受。Ongoing PALAVY（HCQ或avelumab（PD-L1抑制剂）±palbociclib）和ABBY（abemaciclib±HCQ）试验将确定消除DTCs和防止疾病复发的疗效。有几个前列腺癌试验，尽管这些未 specifically 评估休眠或骨转移。

PERK抑制剂

临床前研究证明PERK抑制在HER-2乳腺癌中的疗效。PERK抑制剂HC-5404在晚期实体瘤患者中显示安全性、耐受性和有希望疗效在I期试验中。然而，需要进一步试验以确定PERK抑制剂是否能有效靶向骨中休眠细胞。

结论

最近技术 advancements，特别是单细胞组学，已快速推进休眠领域， uncovering 关键特征、机制和潜在治疗靶标。血管周围MSCs（NG2⁺Nestin⁺）已出现作为促休眠生态位细胞，但骨内膜生态位中的具体成骨细胞谱系亚型和信号通路仍未定义，免疫细胞的可能复杂作用也是如此。虽然休眠维持治疗非治愈性，它们可延迟进展，临床试验正在进行中，利用休眠细胞的内在 vulnerabilities。为识别可能受益于休眠治疗的患者，努力应聚焦于映射跨癌症类型的保守生态位-癌症相互作用，以及细胞异质性是否 enable 耐药克隆的持久性。随着 ongoing 临床试验和临床前研究中出现新靶标，未来几年可能揭示休眠治疗剂是否能有意义地受益和延长骨中癌症患者的生命。