镍-NTA脂质单层亲和网格技术实现高分辨率冷冻电镜结构解析

《Journal of Structural Biology》：Nickel-NTA lipid-monolayer affinity grids allow for high-resolution structure determination by cryo-EM

本研究发现镍-NTA脂质单层亲和网格能有效解决冷冻电镜（cryo-EM）制样中的三大难题：样品在气液界面（AWI）的变性、粒子取向偏好及冰层过厚问题。该技术通过特异性结合多组氨酸标签（poly-His tag）蛋白，实现靶向富集与界面保护，成功解析了2.4-3.1?分辨率结构（包括无对称性<100 kDa蛋白），为难处理样本提供了可推广的高分辨率解决方案。

　　

Overview of Ni-NTA lipid monolayers as a grid support

镍-NTA脂质单层作为网格支撑层的概述

在我们多用户核心设施中，许多项目最终未能获得高分辨率结构。最常见的问题是粒子在气液界面（AWI）出现取向偏好、聚集或复合物解聚，以及蛋白质无法进入网格孔洞。因此我们开始系统性探索脂质单层作为网格支撑层的实用性和可重复性，并向用户推广。除3名核心工作人员外，我们还对6名核心用户（3名博士后、2名研究生...

Discussion

讨论

我们在此提出一种简单且可推广的镍-NTA脂质单层冷冻电镜网格制备方案，并通过现代冷冻电镜技术验证其效用。使用多种蛋白质复合物，我们证明该技术相较于多孔碳支撑膜具有三大优势：（1）将粒子从气液界面（AWI）富集；（2）提高网格粒子吸附量（即更高的网格浓度因子）；（3）形成适用于高分辨率数据收集的超薄冰层（约30 nm）。最重要的是，我们解析了三个分辨率达2.4-3.0?的结构，证明该方法适用于高分辨率研究。此外，我们还解析了一个无对称性、分子量低于100 kDa蛋白质的3.1?结构， demonstrating 该技术对多种生物大分子的普适性。脂质单层可轻松拓展至多数体系，有效缓解低得率、气液界面干扰及冰层过厚等常见问题。

Protein expression and purification

蛋白质表达与纯化

金黄色葡萄球菌谷氨酸合成酶（saGS）按已发表方案（Travis, 2022）稍作修改后进行表达纯化。带组氨酸标签的GS在大肠杆菌 C41(DE3)中表达，经钴镍亲和层析（NTA）和Superdex 200 pg 16/60尺寸排阻色谱纯化。富集GS的组分（24.50 mg/ml）于缓冲液A（50 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM β-巯基乙醇, 5%甘油）中汇合并液氮速冻。

人组蛋白...