猪源样本中猪链球菌（Streptococcus suis）种属、血清型2/1/2与9三重实时荧光定量PCR检测技术的建立及其在扁桃体携带评估中的应用分析

《The Microbe》：Analytical and diagnostic performances of a triplex Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for quantification of Streptococcus suis species, serotypes 2 and 1/2 and serotype 9 in swine biological samples.

本研究针对猪链球菌（S. suis）感染防控中需同时检测高致病性血清型2/1/2与9的迫切需求，开发了一种新型三重qPCR检测技术。该技术基于recN、cps2J和cps9H基因设计引物探针，实现了对S. suis种属（29种血清型）、血清型2/1/2和血清型9的同步定量检测，检测限达5–6 ge/assay，诊断特异性100%、敏感性98%。该技术成功应用于养殖场扁桃体携带监测，为链球菌病的动态监测与精准防控提供了高效技术支撑。

　　

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人畜共患病原体，可引起猪脑膜炎、败血症和多发性浆膜炎，导致断奶仔猪和生长猪死亡，近年来在人类感染中的重要性也日益凸显。目前已知的29种血清型中，血清型2和9是欧洲地区最常从病理病例中分离的型别。由于健康猪扁桃体中常携带无毒力菌株，且抗生素滥用导致耐药性问题严峻，开发能够直接从生物样本中快速鉴别和定量致病性血清型的技术对防控工作具有重要意义。

传统细菌分离鉴定方法耗时长且对混合样本灵敏度低，而现有分子检测方法多局限于单一靶标检测，无法同时实现种属和关键血清型的同步定量。虽然环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增- CRISPR/Cas12（RPA-CRISPR/Cas12）系统等新技术具有快速特点，但无法进行多重靶标检测和精确定量。因此，研发一种可同时检测S. suis种属、血清型2/1/2和血清型9的高通量定量PCR（qPCR）方法具有重要应用价值。

本研究成功建立了一种三重qPCR检测方法，靶向recN（种属特异性）、cps2J（血清型2/1/2）和cps9H（血清型9）基因，采用TaqMan水解探针技术，并分别标记Cy5、Texas Red和FAM荧光报告基团。该方法在25次独立实验中显示出高扩增效率（97.4%-100%）和线性（R2>0.998），检测限为5-6基因组当量（ge）/assay，重复性良好（CV<3%）。使用127株S. suis菌株和43株非S. suis菌株验证显示 analytical specificity（分析特异性）为100%。

在诊断性能评估中，使用74份SPF（无特定病原体）猪样本和126份感染猪样本进行验证。结果显示，诊断特异性为100%，诊断敏感性为98%。与已发表的单靶标检测方法相比，三重qPCR的结果一致性高（Kappa系数0.968–0.983），定量结果无显著差异。

研究人员进一步将该技术应用于法国布列塔尼地区一个遭受链球菌病困扰的农场，采集180份扁桃体拭子样本（涵盖48小时龄仔猪至25周龄育肥猪），通过化学裂解法快速提取DNA后直接进行三重qPCR检测。

3.3. Detection and quantification of S. suis, serotypes 2 and 1/2 and serotype 9 on farm

研究发现所有样本均检出S. suis（100%阳性），而血清型2/1/2和9的阳性率分别为38%和29%。细菌载量分析显示S. suis总载量（4.80±0.78 log₁₀ ge/ml）显著高于血清型特异性载量（p<0.0001）。不同生理阶段携带率存在差异：血清型2/1/2在断奶后期检出率最高（90%），而血清型9在断奶前已有较高携带率（40%）。研究还发现即使未表现临床症状的育肥后期猪只仍携带一定数量的病原（10%阳性），提示存在隐性感染源。

本研究开发的triplex qPCR assay具有高灵敏度、特异性和多重检测能力，可直接应用于临床样本检测，避免了繁琐的细菌培养过程，将检测时间从3天缩短至6小时。该技术不仅能准确量化S. suis总菌量和主要致病血清型，还能发现样本中可能存在的其他血清型（通过总菌量与血清型特异性检测值的差异推断），为感染动态监测提供了全新工具。

研究发现养殖场中S. suis携带率高达100%，且主要致病血清型在不同生理阶段呈现动态变化，这表明单纯检测病原存在不足以评估疾病风险，定量监测关键血清型的动态变化更为重要。研究还提示母乳喂养阶段可能是血清型9感染的关键期，而断奶后阶段则是血清型2/1/2感染的高风险期，这一发现为制定阶段化防控策略提供了科学依据。

该技术的成功应用为猪链球菌病的监测与控制提供了强有力的技术手段，不仅可用于兽医诊断实验室的常规检测，也可用于人类感染病例的病原鉴定，同时为流行病学研究和疫苗评价研究提供了高效平台。通过实时监测养殖场内主要致病血清型的动态变化，养殖户可精准把握用药时机，减少抗生素滥用，从而应对日益严峻的抗生素耐药性问题。