克隆性造血与炎症协同预测BCMA靶向CAR-T细胞疗法后的血液学毒性及继发性髓系恶性肿瘤

《Clinical Cancer Research》：Clonal Hematopoiesis and Inflammation Predict Hematologic Toxicity and Secondary Myeloid Malignancies after B-Cell Maturation Antigen–Directed Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy Open Access

本研究发现，BCMA CAR-T治疗后持续性血液学毒性（≥3级中性粒细胞减少或血小板减少）与较差的无进展生存（PFS）和总生存（OS）显著相关。研究揭示了基线炎症（如铁蛋白≥300 ng/mL）和克隆性造血（CH）的共存是延迟造血恢复的强力预测因子（调整后HR=0.38, P=0.006）。尤为重要的是，继发性髓系恶性肿瘤（9%发生率）的发生与基线已存在的TP53突变克隆在CAR-T后的扩增密切相关（VAF从3.4%升至44.0%）。该研究强调了炎症与CH的相互作用在CAR-T毒性中的核心作用，并为风险分层提供了关键见解。

　　

Abstract

目的（Purpose）:

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）在多发性骨髓瘤中展现出显著疗效，但持久的血液学毒性仍是常见不良事件，继发性髓系恶性肿瘤也是一个重要的安全性问题。

实验设计（Experimental Design）:

研究评估了213例在接受BCMA靶向CAR-T治疗的骨髓瘤患者，旨在分析与血液学毒性相关的临床、炎症及髓系克隆特征。

结果（Results）:

在输注后第100天仍存在持续性≥3级中性粒细胞减少或血小板减少的患者（占19%）具有较短的无进展生存期（PFS, P=0.0003）和总生存期（OS, P<0.0001）。在持续缓解的患者中，64%出现了持续超过1年的高级别血细胞减少。基线炎症是血液学毒性的风险因素，而潜在的克隆性造血（CH）调节了这一风险，CH与高铁蛋白的组合对延迟恢复具有高度预测性（调整后风险比HR=0.38, P=0.006）。对髓系恢复延迟患者的血清细胞因子分析显示，存在持续性炎症和内皮功能障碍的特征。最终，9%的患者发展为继发性髓系疾病，其中5%为需要治疗的高级别骨髓增生异常综合征（MDS），中位发生时间为CAR-T后14.5个月。MDS的发生与先前存在的TP53突变CH克隆的扩增相关，其中位变异等位基因频率（VAF）从CAR-T前的3.4%增至44.0%。具有基线TP53突变CH的患者表现出克隆进化且MDS发生率很高（67%），而其他CH突变在CAR-T后未显示类似的扩增（P>0.99）。

结论（Conclusions）:

本研究强调了血液学毒性和CH对BCMA CAR-T结局的影响，并表明CAR-T可能在影响TP53克隆动态和髓系疾病发展中具有潜在作用。

引言（Introduction）

靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）改变了多发性骨髓瘤的治疗格局，但在重度预处理患者中实现持久反应的同时，细胞疗法带来的炎症毒性仍是重大挑战。免疫效应细胞相关血液毒性（ICAHT）表现为髓系毒性恢复时间延长，是CAR-T治疗后常见的不良事件。此外，在BCMA CAR-T的早期试验的2年随访中，10%的患者发展为骨髓增生异常综合征（MDS）或急性髓系白血病（AML）。

延迟的血液学恢复与较差的生存结局、严重感染和非复发死亡率相关。先前的回顾性分析已确定基线炎症标志物是关键风险因素，并由此验证了CAR-HEMATOTOX评分用以预测早期血液学毒性风险。然而，该领域多数工作聚焦于CD19靶向产品，针对BCMA的研究规模较小。此外，CAR-T后血液学毒性的定义各异，许多分析主要关注30天内的毒性，对持续超过1个月的细胞减少的评估不够充分。

继发性髓系疾病通常由克隆性造血（CH）进展而来。CH是一种克隆性造血干细胞体细胞突变引起的癌前病变，可进展为克隆性血细胞减少（CCUS），并最终导致MDS/AML。CH驱动慢性炎症状态，突变克隆具有生长优势，能抵抗炎症损伤。因此，CH克隆创造一个正反馈循环，选择自身扩增，并导致炎症性血细胞减少和髓系疾病。CH在多发性骨髓瘤患者中很常见，治疗暴露后发生率增加，在既往接受CAR-T治疗的队列中高达50%存在。然而，BCMA CAR-T后CH的克隆动态及其对髓系疾病的贡献尚未完全阐明。

本研究旨在深入分析本中心大型BCMA CAR-T队列，以更好表征与持久髓系毒性相关的临床预测因素，重点关注持续恢复和脱离血液学支持。研究评估了细胞因子 panel 和CH在临床特征背景下的作用，以更好定义驱动CAR-T后血液学毒性的风险因素。此外，还展示了发生继发性髓系恶性肿瘤患者的克隆动态，以评估BCMA CAR-T在介导髓系疾病进展中的作用。

材料与方法（Materials and Methods）

临床数据收集（Clinical data collection）

研究回顾了自2017年以来在本中心接受BCMA导向CAR-T产品治疗的患者，方案经机构审查委员会批准并豁免知情同意，遵循赫尔辛基宣言。高危细胞遗传学异常（HRCA）定义为t(4;14), t(14;16), t(14;20), 1q增益/扩增, del(1p), 或 del(17p)。细胞因子释放综合征（CRS）根据美国移植与细胞治疗学会共识标准分级。CAR-HEMATOTOX评分按先前描述计算，评分≥2视为高危。微小残留病（MRD）通过二代流式（灵敏度10^?5）或通过clonoSEQ的二代测序（NGS，灵敏度10^?6）进行。

髓系恢复（Myeloid recovery）

记录CAR-T后直至骨髓瘤进展的绝对中性粒细胞计数（ANC）、血小板（PLT）和血红蛋白（Hgb）值，缺失值使用周围可用数据的线性轨迹赋值，每日实验室值按不良事件常用术语标准分级。对于每种细胞系，持续恢复日期定义为连续30天期间数值持续高于3级毒性阈值（ANC ≥1,000个细胞/μL, PLT ≥50 k/μL, Hgb ≥8 g/dL）且无需输血或生长因子支持的第一天。

克隆性造血（CH）

查询了患者作为临床护理一部分而获取的可用靶向NGS panel（来自外周血或骨髓抽吸物样本）。基因组测序由第三方商业平台完成，识别与血液恶性肿瘤相关的致病性突变。CH的定义是存在致病性髓系突变，使用常规变异等位基因频率（VAF） cutoff ≥2%，CH基因完整列表见Supplementary Table S1。选择CAR-T输注前或输注后1年内最接近的可用样本。认识到一些经典CH基因可能存在于髓系或骨髓瘤克隆中，分析限制在通过免疫组化（IHC）检测浆细胞<10%的外周血或骨髓样本，并使用一组在多发性骨髓瘤中不常见突变的常见髓系基因（CH-R: DNMT3A, TET2, ASXL1, 和 PPM1D）进行了额外分析。

细胞因子检测（Cytokine assays）

在0到14天之间使用Olink Target 96 Immuno-Oncology panel 连续测量血清细胞因子，遵循制造商方案。简言之，使用寡核苷酸标记的抗体结合靶蛋白，随后通过qPCR扩增靶寡核苷酸序列。结果以归一化蛋白表达（NPX）的对数log₂尺度报告。

统计分析（Statistical analysis）

通过Kaplan-Meier分析和对数秩显著性检验评估无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）和恢复时间。通过Cox比例风险模型进行生存风险比（HR）和多变量分析。离散数据通过Fisher精确检验比较，连续数据使用Welch t检验比较。对于细胞因子，进行了landmark分析，排除了在第14天前恢复或在第100天前出现骨髓瘤进展的患者。应用重复测量的线性混合效应模型研究按恢复状态分组的表达变化，包含相关交互项，并使用似然比检验确定时间趋势在组间是否存在差异。通过Mann-Whitney U检验比较中位VAF值。通过线性回归评估先前治疗线与发生MDS/AML时间之间的相关性。分析在R（版本4.4.2）中进行。P < 0.05的结果被认为具有统计学显著性。

结果（Results）

临床数据和髓系恢复（Clinical data and myeloid recovery）

研究纳入213例接受BCMA导向CAR-T治疗的多发性骨髓瘤患者，且至少有30天随访。患者中位随访时间为19个月，临床和人口统计学数据见表1。患者中位年龄61岁，58%为男性，中位既往治疗线数为5，其中77%为三重难治，32%为五药难治，76%有既往自体干细胞移植（ASCT）史。患者表现出高风险特征的高患病率，包括68%具有≥1个HRCA，在有可用数据的161例患者中有81例（50%）为国际分期系统（ISS）II-III期疾病。总计55%接受ciltacabtagene autoleucel，35%接受idecabtagene vicleucel，55%在临床试验中接受治疗。

从任何≥3级髓系毒性（即ANC、PLT和Hgb）中恢复的中位时间为39天。到CAR-T后30天，63%的患者至少一个细胞系尚未达到持续恢复，包括57%和34%分别没有ANC或PLT恢复，32%存在多系血细胞减少。对于第100天的分析，28例患者因在该日期前疾病进展或死亡而被删失，留下185/213（87%）可评估血细胞减少。到第100天，35/185（19%）表现出至少一种持续性≥3级髓系血细胞减少，包括12%和15%分别没有持续ANC或PLT恢复，9%存在持续的多系血细胞减少。

自体干细胞加强输注先前已被证明可加速CAR-T后具有持续血细胞减少的部分患者的血液学恢复。由于机构实践，本队列中仅一例患者接受了干细胞加强，该患者因第100天后持续的4级血小板减少而接受输注。该患者在干细胞加强约4周后达到PLT恢复，但随后在6个月时因多重感染并发症死亡。

延迟的髓系恢复与较差的生存和1年时持续性血细胞减少相关（Delayed myeloid recovery associated with poor survival and persistent cytopenias at 1 year）

在第100天未达到持续髓系恢复的患者表现出显著较短的中位PFS（15 vs. 29个月；P=0.0003）和降低的24个月OS（54.6% vs. 87.0% [HR, 3.43, 95% CI, 1.78–6.61; P=0.0002]）。类似地，在第30天未达到持续恢复的患者有PFS变短的趋势（21 vs. 29个月；P=0.056）和显著较短的OS（HR, 5.27; 95% CI, 2.25–12.40; P=0.0001）。在对其他风险因素（包括年龄、既往治疗线数、HRCA、CAR产品和炎症标志物）进行多变量调整后，延迟超过100天的髓系恢复仍然是PFS[调整后HR (aHR), 1.91; 95% CI, 1.05–3.47; P=0.03]和OS (aHR, 2.50; 95% CI, 1.15–5.44; P=0.02)的显著驱动因素。

接下来评估了第100天时存在持续性血细胞减少患者的长期血液学恢复模式。如上所述，35/185可评估患者（19%）恢复延迟超过100天；其中26例在6个月时持续缓解，22/26（85%）存在持续性≥3级髓系毒性（88%为≥2级），20/26（77%）需要持续使用生长因子。在1年时，14例有足够随访的患者仍处于缓解状态，仅另有3例患者实现了髓系恢复。在14例缓解者中，9例（64%）存在持续性≥3级血细胞减少（79%为≥2级）。在所有维持1年缓解的患者中，第100天时有血细胞减少的患者与早期恢复的患者相比，显著更可能具有持续性≥3级血细胞减少（64% vs. 8%；P<0.0001）或生长因子依赖（50% vs. 5%；P<0.0001）。总之，这些数据表明，BCMA CAR-T后持续血液学恢复时间延长的患者生存结局显著更差，并且在那些达到并维持深度缓解的患者中，相当大比例出现持续超过1年的持续性高级别血细胞减少。

与延迟髓系恢复相关的临床特征（Clinical features associated with delayed myeloid recovery）

鉴于其与生存的关联，分析了预测队列中持续血液学恢复时间延长的基线临床特征。患者中位恢复时间在以下情况增加：≥4线既往治疗（42 vs. 25天；P<0.0001），包括三重难治（48 vs. 29天；P<0.0001）或五药难治（49 vs. 36天；P=0.049），≥2个HRCA（49 vs. 35天；P=0.015），基线铁蛋白≥300 ng/mL（52 vs 32天, P<0.0001）或高CAR-HEMATOTOX评分（63 vs. 34天；P<0.0001）。值得注意的是，每个特征在多变量调整后均保持统计学显著性。相比之下，持续髓系恢复时间与年龄、CAR-T产品、临床试验入组、ISS分期、CRS发生率（任何级别）或严重CRS（≥3级）的存在无显著相关。先前报道过具有Duffy-null血型基因型的个体在CAR-T治疗后经历 prolonged low-grade neutropenia，但它不是更严重（≥3级）中性粒细胞减少的显著预测因子。

CH与并发炎症预测延迟髓系恢复（CH and concurrent inflammation predict delayed myeloid recovery）

总计213例CAR-T接受者中有90例（42%）有在CAR-T前中位2.5个月收集的符合预定可评估标准的可用NGS数据，其中35/90（39%）具有VAF≥2%的CH相关突变。CH患者年龄更大（中位66 vs. 61岁），但既往治疗线数（中位6 vs. 6）、HRCA（77% vs. 60%）和ISS II-III期疾病（67% vs. 57%）在统计学上相似。最常见的突变CH基因是DNMT3A（18%）、TP53（12%）、TET2（6%）、ASXL1（6%）和PPM1D（2%）。CH突变分布与先前骨髓瘤队列相似，但总体患病率更高，尤其是TP53，与更重度预处理人群一致。

CH患者显著更可能在100天后出现延迟PLT（38% vs. 11%；P=0.006）和髓系恢复（41% vs. 19%；P=0.04）。当单独按CH分层时，CH患者髓系恢复时间在数值上更长但无统计学显著性（中位45 vs. 36天；P=0.12），且不同突变间无差异。鉴于CH和炎症在加剧血细胞减少和克隆生长中的相互作用，评估了CH和基线铁蛋白在预测髓系毒性中的影响。低铁蛋白且无CH的患者（中位34天）与单独任一风险因素患者（包括低铁蛋白的CH（中位35天）或无CH的高铁蛋白（中位40.5天）的恢复时间相当。然而，同时具有CH和铁蛋白升高的患者与其余患者相比，显示出显著延迟的血液学恢复（中位未达到；HR, 0.34; 95% CI, 0.17–0.66; P=0.0009）。CH与高铁蛋白的组合在对年龄、既往治疗线数和HRCA进行多变量调整后，仍然是恢复时间的显著预测因子，与低铁蛋白患者相比，aHR为0.38（95% CI, 0.19–0.72; P=0.006）。类似地，CH与高铁蛋白对PFS和OS有数值上（虽无统计学显著性）的影响。

为进一步降低将骨髓瘤突变归类为CH的风险，进行了敏感性分析，使用限制性髓系基因列表（CH-R: DNMT3A, TET2, ASXL1, 和 PPM1D）。去除了9例具有其他可能重叠骨髓瘤突变的CH患者，留下26例CH-R患者。CH-R队列表现出与CH相似的行为，因为孤立的CH-R（中位41.5天）或单独铁蛋白升高（中位40.5天）对髓系恢复的影响不显著，但两者的组合对恢复具有统计学显著影响，且在多变量分析后持续存在（中位61天；aHR, 0.41; 95% CI, 0.18–0.97）。总之，虽然升高的炎症标志物是血液学毒性的已知风险因素，但CH的存在显著调节了这一风险，并且并发CH和铁蛋白升高的患者比单独任一风险因素患者的恢复时间显著更长。

延迟髓系恢复与免疫和内皮功能障碍相关（Delayed myeloid recovery associated with immune and endothelial dysregulation）

接下来在53例具有从CAR-T输注到第14天连续时间点血清细胞因子panel的患者亚组中，研究了与延迟髓系恢复相关的特定炎症通路。髓系恢复延迟超过30天的患者甚至在CAR-T输注前就表现出独特的炎症特征，其特征是促炎细胞因子（TNFα和IFNγ）、细胞毒性标志物（颗粒酶A、B和H）和可溶性T细胞共刺激分子（CD28、4-1BB、CD27和CD40）升高，提示炎症和免疫激活状态增强。这种炎症特征持续到第14天，同时可溶性免疫检查点分子表达增加，包括受体PD-1和LAG-3以及配体PD-L1和半乳糖凝集素-9，反映了持续的免疫失调。同时，这些患者中出现内皮功能障碍标志物，表现为ANGPT1、PDGFB和EGF的进行性下调，以及ANGPT2增加和ANGPT2:ANGPT1比率升高。这种失衡与血管功能障碍和 destabilization 相关，并已在严重CAR-T毒性中被牵涉，包括CRS、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、凝血功能障碍和 prolonged neutropenia。尽管第14天后的细胞因子数据有限，但作为持续炎症的代理指标，延迟髓系恢复患者的连续铁蛋白水平至少到第100天仍保持升高。总之，这些发现表明，持续的免疫激活和内皮功能障碍可能导致持续的髓系毒性以及该患者群体中更高的疾病复发风险。

继发性髓系恶性肿瘤的发生率和临床特征（Incidence and clinical features of secondary myeloid malignancies）

接下来评估了队列中发展为意义不明的克隆性造血（CCUS）、MDS或AML（作为延迟血液学毒性的表现）的情况。初步审查中，根据髓系克隆性