利用液-液界面培养技术消除hiPS-RPE细胞表型异质性：一种促进视网膜色素上皮细胞均匀成熟的新策略

《New Biotechnology》：Cultivation at a liquid–liquid interface prevents phenotypic heterogeneity of human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelial cells

本研究针对人诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hiPS-RPE）在传统固-液界面培养中出现表型异质性的难题，开发了基于层粘连蛋白-332包被的液-液界面培养新方法。研究人员通过ROCK抑制剂Y27632和福斯高林（forskolin）的时序性调控，成功实现了hiPS-RPE细胞的均匀成熟， tight junction形成指标FZ和均匀性指数HLN分别达到0.97和0.95。该研究为细胞治疗和药物筛选提供了高质量、均一化的细胞来源，具有重要的转化应用价值。

　　

在再生医学和药物研发领域，人诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（hiPS-RPE）已成为治疗视网膜变性疾病和进行药物筛选的重要细胞来源。然而，这些细胞在传统的聚苯乙烯固-液界面培养过程中，常常出现自发的表型异质性——在同一代次细胞群体中，同时存在铺路石状、圆顶状和分层化等不同形态的细胞。这种异质性不仅影响细胞功能的稳定性，更对细胞治疗的安全性和药物筛选的可靠性构成严峻挑战。特别是在细胞移植治疗中，表型异质的细胞群体可能导致不可预测的体内行为，甚至引发肿瘤风险。因此，如何实现hiPS-RPE细胞的均匀成熟，获得表型一致的高质量细胞群体，成为该领域亟待解决的关键科学问题。

近日发表在《New Biotechnology》的研究论文中，日本九州大学化学工程系的Rie Sonoi和Masamichi Kamihira教授团队开发了一种创新的液-液界面培养策略，成功解决了hiPS-RPE细胞的表型异质性问题。研究人员发现，通过将细胞培养在氟化油Novec-7500形成的液-液界面上，并结合时序性的信号通路调控，能够显著促进细胞的均匀成熟，抑制圆顶状结构的形成，从而获得表型高度一致的hiPS-RPE细胞群体。

研究团队主要采用了液-液界面培养技术、免疫荧光染色分析、细胞衰老检测（SA-β-gal活性测定）、乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测以及定量图像分析方法。hiPS-RPE细胞来源于Fujifilm Wako公司（供体#01279），通过在层粘连蛋白-332包被的固-液或液-液界面上进行高密度培养，评估了不同培养条件下细胞的表型特征和功能成熟度。

3.1. 不同界面下细胞附着效率的比较

研究人员首先比较了hiPS-RPE细胞在固-液和液-液界面的附着效率。结果显示，在层粘连蛋白-332包被的液-液界面上，经ROCK抑制剂Y27632处理的细胞表现出最高的附着效率（X_t=24h/X_t=0 = 0.99），而未包被的液-液界面则完全无细胞附着。形态学分析表明，Y27632处理的细胞表现出铺路石样形态并形成紧密连接，而福斯高林处理的细胞形态与未处理组相似。这些结果表明，层粘连蛋白-332包被和Y27632处理共同促进了hiPS-RPE细胞在液-液界面的附着。

3.2. 培养容器中RPE成熟过程中固-液或液-液界面的表型异质性差异

时间进程分析显示，在固-液界面上，hiPS-RPE细胞从t = 10天开始出现圆顶状结构，这些结构随着培养进程被破坏。到t = 35天时，圆顶状结构主要出现在培养容器的外周区域。相反，在层粘连蛋白-332包被的液-液界面上，细胞在Y27632转换为福斯高林的条件下维持附着，呈现铺路石样形态并产生色素，且不形成圆顶状结构。这些细胞在t = 35天时在整个界面区域表现出均匀的成熟。

3.3. 液-液界面培养防止表型异质性的出现

免疫荧光染色分析显示，在层粘连蛋白-332包被的液-液界面上经Y27632转换为福斯高林处理的hiPS-RPE细胞，几乎所有细胞都呈现铺路石样形态和均匀成熟，ZO-2染色清晰勾勒出细胞边界。定量分析表明，液-液界面上细胞的均匀性指数H_LN和ZO-2阳性细胞频率F_Z在中心和外周区域高度一致（H_LN = 0.95，F_Z = 0.97），且两者之间存在强相关性（R2 = 0.97）。这表明液-液界面培养有效抑制了表型异质性的出现。

研究结论表明，在层粘连蛋白-332包被的液-液界面上培养hiPS-RPE细胞，特别是采用从Y27632转换为福斯高林的时序性处理策略，能够有效促进细胞的均匀成熟，抑制圆顶状结构的形成，从而实现表型的高度一致性。这种培养策略通过调节细胞-细胞和细胞-基质粘附，平衡Rap1和ROCK信号通路的活性，维持了上皮细胞的稳定状态。

该研究的重要意义在于提供了一种可靠的技术平台，用于生成高质量、表型均一的hiPS-RPE细胞群体，这不仅为视网膜变性疾病的细胞治疗提供了更安全的细胞来源，也为药物筛选和毒性测试提供了更可靠的体外模型。液-液界面培养技术的成功应用，为其他类型上皮细胞的体外培养和成熟调控提供了新的思路和方法借鉴。此外，研究中建立的定量评估体系（H_LN和F_Z指标）为评估上皮细胞成熟质量提供了客观标准，具有重要的方法论价值。这项技术的进一步发展可能推动再生医学领域向更精准、更安全的方向迈进。