铁死亡与放疗相关基因在头颈鳞癌中的诊断预后价值及免疫微环境调控新机制

《Hormones & Cancer》：Ferroptosis and radiotherapy-related genes in head and neck squamous cell carcinoma: diagnostic and prognostic significance

本研究针对头颈鳞状细胞癌（HNSCC）预后差、五年生存率低的临床难题，通过整合TCGA和GEO数据库多组学分析，首次系统鉴定了11个铁死亡与放疗相关差异表达基因（F&RRDEGs），构建了新型分子分型系统和预后模型。实验验证发现ALOX12、EMP1、PIM1和CA9具备显著诊断价值，并证实放疗通过上调VDAC1/TFRC、下调GPX4/SLC7A11诱导铁死亡。该研究为HNSCC个体化治疗提供了新型生物标志物和联合治疗策略。

　　

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，患者五年生存率长期低于70%，成为重大公共卫生挑战。当前治疗方案包括手术切除、放疗、化疗和免疫治疗等多种手段，但数十年来生存率改善有限。肿瘤部位特异性复发是治疗失败的主要原因，因此识别高危患者并开发创新疗法对实现个体化治疗至关重要。

在这一背景下，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，因其在癌症治疗中的潜在作用日益受到关注。这种细胞死亡机制不同于传统的凋亡或坏死，其特征是富含多不饱和脂肪酸的磷脂发生过氧化反应。尤其值得注意的是，放射治疗已被证明能够通过活性氧（ROS）依赖性脂质过氧化在HNSCC中诱导铁死亡，而免疫检查点阻断疗法中CD8⁺T细胞产生的干扰素-γ（IFN-γ）也能通过促进铁死亡发挥抗肿瘤作用。然而，铁死亡与放疗交叉对话基因在HNSCC中的预后价值尚未明确，阻碍了这一协同机制的临床转化。

为解决这一科学问题，范立元等研究人员在《Discover Oncology》上发表了题为"Ferroptosis and radiotherapy-related genes in head and neck squamous cell carcinoma: diagnostic and prognostic significance"的研究论文，系统探讨了铁死亡与放疗相关基因在HNSCC中的诊断和预后意义。

研究人员采用多组学整合分析策略，主要关键技术方法包括：从TCGA-HNSCC数据库获取414例肿瘤样本和20例正常对照的转录组数据，同时从GEO数据库获取GSE6631（22例HNSCC vs 22例正常）和GSE107591（24例HNSCC vs 23例正常）数据集进行验证；通过差异表达分析筛选铁死亡与放疗相关差异表达基因（F&RRDEGs）；利用共识聚类进行分子分型；采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算铁死亡与放疗评分（F&Rs）；通过免疫浸润分析评估肿瘤微环境特征；构建Cox预后模型并利用校准曲线和决策曲线分析（DCA）验证模型性能；最后使用实时定量PCR（RT-qPCR）和Western blotting（WB）进行实验验证。

3.1 技术路线

研究数据收集与分析流程明确，每个步骤在后续部分有详细阐述。

3.2 数据预处理和批次效应消除

通过limma软件包对GSE6631和GSE107591数据集进行标准化处理，显著降低了样本间的批次效应，使样本表达模式更加一致。

3.3 放疗相关差异表达基因

研究人员通过三个数据集的差异表达分析，获得了DEGs、FRGs和RRGs的交集，最终鉴定出11个重叠基因（FSCN1、AURKA、EMP1、CA9、ENO2、ALOX12、IGF2BP3、GJA1、FAT1、PIM1、MUC1），称为F&RRDEGs。主成分分析（PCA）结果显示两组间存在显著差异。Wilcoxon秩和检验结果表明，在TCGA-HNSCC数据集中，10个F&RRDEGs存在统计学显著表达差异。

3.4 F&RRDEGs表达差异分析和ROC分析

在三个数据集中比较了F&RRDEGs在对照组和HNSCC组中的基因表达差异，并为10个基因创建了ROC曲线。结果显示，ALOX12、CA9、ENO2、FAT1、GJA1和IGF2BP3在多个数据集中 consistently 表现出高诊断价值，表明它们作为HNSCC诊断可靠生物标志物的潜力。

3.5 F&RRDEGs的突变和拷贝数变异分析

对HNSCC患者中11个F&RRDEGs的突变景观分析显示，主要突变类型包括无义突变、错义突变、移码缺失、移码插入和转录起始位点框内缺失，其中无义突变占显著比例。拷贝数变异（CNV）分析显示，这些基因中很大一部分存在CNV，尤其是在CA9基因中更为常见。

3.6 F&RRDEG的通路和功能富集分析

对TCGA-HNSCC数据集的分析显示，基因在几个关键通路中显著富集，包括Notch4信号负调控、PDT诱导的NFkB生存信号、TP53调控细胞周期基因转录、氧化应激诱导衰老、细胞衰老和DNA损伤端粒应激诱导衰老。此外，F&RRDEGs在多种生物过程中普遍存在，包括细胞极性、顶/基底细胞极性、单极细胞极性以及HNSCC样本中细胞极性的维持。

3.7 F&RRDEGs的相关性分析和亚型构建

通过共识聚类分析，研究人员将HNSCC样本分为两个明显亚型：cluster 1和cluster 2。HNSCC亚型1（cluster 1）包含260个样本，而HNSCC亚型2（cluster 2）包含154个样本。两个HNSCC亚型在PCA聚类结果中表现出明显区别。表达热图显示，11个F&RRDEGs在两个cluster中的表达水平存在显著负相关。

3.8 HNSCC亚型中标志基因集的GSVA分析

通过GSVA分析发现，13个筛选的标志基因集在cluster 1和cluster 2之间存在显著富集差异。这些通路包括缺氧、糖酵解、DNA修复、Notch信号、Kras信号下调、Hedgehog信号、胰腺β细胞、上皮-间质转化（EMT）、Mtorc1信号、Wnt Beta连环蛋白信号、胆汁酸代谢、Myc靶标V1和血管生成。

3.9 F&Rs构建和临床相关性分析

使用ssGSEA方法计算每个样本的F&Rs，根据F&Rs中位数将HNSCC样本分为低分和高分组。通过比较F&RRDEGs的表达程度发现，9个F&RRDEGs（ALOX12、AURKA、CA9、EMP1、ENO2、FAT1、FSCN1、IGF2BP3、MUC1）在高分组中表现出强表达，表明它们在预后和潜在临床应用中的相关性。

3.10 免疫浸润和免疫治疗分析

免疫浸润分析显示，低分组和高分组之间19个免疫细胞的浸润存在显著差异。特定F&RRDEGs与免疫细胞浸润水平之间的相关性分析表明，在F&Rs低分组中，FAT1、EMP1和PIM1与免疫细胞密切相关；而在高分组中，ENO2和ALOX12与免疫细胞呈强负相关。免疫表型评分（IPS）分析显示，CTLA4和PD1/PD-L1/PD-L2表达水平在低风险和高风险组之间存在显著差异，表明F&RRDEGs可作为免疫治疗结果的预测标志物。

3.11 临床预后Cox模型构建

基于HNSCC患者的临床病理参数（年龄、性别和分期）以及11个F&RRDEGs的F&Rs，研究人员进行了单因素Cox回归分析。多因素分析中，肿瘤分期的影响大于其他因素。校准曲线显示，多因素Cox预后模型在1年时表现出更好的预测性能。决策曲线分析（DCA）评估了模型在1年、3年和5年的临床效用，显示5年预测效果优于3年，3年优于1年。

3.12 基因和蛋白表达验证

Western blot验证显示，经放疗处理的HNSCC细胞中VDAC1和TFRC表达增加，GPX4、SLC7A11和FTH1下调，证实HNSCC细胞放疗与铁死亡通路密切相关。RT-qPCR和WB验证发现，与对照组相比，HNSCC中ALOX12、PIM1和EMP1下调，而CA9显著过表达。同时，WB验证了NF-κB信号通路相关蛋白在HOK和SCC25细胞中的表达，证实p-NFκBp65和p-IKBα在HNSCC中显著增加，表明NF-κB信号通路在HNSCC中的潜在作用。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次系统鉴定了HNSCC中铁死亡与放疗相关基因，并构建了新型分子分型系统和预后模型。实验验证发现ALOX12、EMP1、PIM1和CA9具备显著诊断价值，并证实放疗通过调控VDAC1/TFRC（促铁死亡）和GPX4/SLC7A11/FTH1（抗铁死亡）诱导铁死亡。这一发现为理解放疗抗性机制提供了新视角，同时为开发联合治疗策略奠定了理论基础。

值得注意的是，研究观察到NF-κB通路在HNSCC细胞中组成性激活，这与DNA损伤反应中抗凋亡/抗铁死亡臂的异常激活可能相关，使肿瘤细胞能够在放疗诱导的应激下存活和产生抵抗。因此，NF-κB通路抑制剂与铁死亡诱导剂联合使用可能协同阻断促生存信号，增强HNSCC的放疗敏感性。

该研究的创新性在于将免疫浸润分析应用于HNSCC研究，为患者特异性治疗方案提供了新视角，加速了针对性疗法的开发。然而，研究也存在一定局限性，如公共数据集的回顾性性质可能引入选择偏倚，关键基因在铁死亡和放疗抗性中的功能角色需要进一步机制研究，预后模型缺乏外部临床验证等。

未来研究方向应包括功能验证实验、更大规模的前瞻性队列研究以及多组学整合，以完善临床适用性。总体而言，这项研究为探索铁死亡与放疗之间的分子交叉对话、开发靶向干预措施以及改善HNSCC患者护理提供了新的理论基础和实践方向。