硫酸肝素酶2通过调控VEGF/VEGFR通路抑制胆囊癌生长的机制研究

《Hormones & Cancer》：Heparanase2 inhibits the growth of gallbladder cancer by regulating the VEGF/VEGFR pathway

本研究发现硫酸肝素酶2(Hpa2)通过调控VEGF/VEGFR信号通路显著抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。研究人员通过体外实验和裸鼠体内实验证实，Hpa2过表达可降低VEGF/VEGFR通路相关蛋白表达水平，促进细胞凋亡和活性氧(ROS)产生，而VEGF/VEGFR通路激动剂Mersalyl可逆转Hpa2的抑癌作用。该研究为胆囊癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点。

　　

胆囊癌是一种罕见但高度恶性的肿瘤，由于其早期诊断困难且缺乏有效的靶向治疗方法，患者预后普遍较差。虽然手术切除是目前唯一可能治愈的手段，但胆囊癌的高复发率和转移特性凸显了寻找新的治疗靶点和深入了解其分子发病机制的重要性。

在这一背景下，硫酸肝素酶家族成员引起了研究人员的关注。与已知促进癌症转移的硫酸肝素酶1(Hpa1)不同，硫酸肝素酶2(Hpa2)作为其同源物，虽然缺乏传统的肝素降解活性，但对硫酸肝素(HS)具有更高的亲和力。近年来的研究表明，Hpa2可能在调节肿瘤微环境和细胞迁移、侵袭等过程中发挥重要作用，但其在胆囊癌中的具体功能尚不明确。

为了探索Hpa2在胆囊癌中的作用机制，曹登义等人开展了一项深入研究。研究人员通过构建Hpa2过表达的胆囊癌细胞系，综合运用多种实验方法，揭示了Hpa2通过调控VEGF/VEGFR信号通路抑制胆囊癌生长的分子机制。这项研究结果发表在《Discover Oncology》期刊上，为胆囊癌的治疗提供了新的思路。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：通过实时荧光定量PCR和Western blot验证转染效率；使用CCK-8法检测细胞增殖能力；通过Transwell实验和伤口愈合实验评估细胞迁移和侵袭能力；采用流式细胞术分析细胞凋亡情况；利用ELISA和免疫荧光技术检测VEGF/VEGFR通路相关蛋白表达；通过裸鼠移植瘤实验验证体内抑瘤效果；运用免疫组织化学分析肿瘤组织中的血管生成相关标志物表达。研究所用的人NOZ和GBC-SD胆囊癌细胞系购买自中国浙江美森CTCC，动物实验使用BALB/c裸鼠，所有实验均经过蚌埠医学院实验动物管理与伦理委员会批准。

3.1 验证转染效率

研究人员通过慢病毒转染技术成功构建了Hpa2过表达的NOZ和GBC-SD细胞系。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示，NOZ-Hpa2细胞中Hpa2的mRNA和蛋白表达水平显著高于NOZ-Blank细胞和正常NOZ细胞，表明Hpa2过表达细胞模型构建成功。

3.2 硫酸肝素酶2抑制胆囊癌细胞的生长

CCK-8实验结果显示，Hpa2过表达显著抑制了NOZ细胞和GBC-SD细胞的增殖能力。伤口愈合实验和Transwell迁移侵袭实验表明，NOZ-Hpa2组细胞的迁移和侵袭能力明显降低。细胞集落形成实验进一步证实，Hpa2过表达显著减少了细胞集落数量。这些结果共同表明Hpa2能够抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

3.3 硫酸肝素酶2抑制VEGF表达并促进活性氧产生和细胞凋亡

ELISA和Western blot分析显示，Hpa2过表达降低了细胞培养上清液中VEGF因子的分泌量，同时细胞内VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFR1和VEGFR2的蛋白表达水平也显著下降。当加入VEGF/VEGFR通路激动剂Mersalyl后，Hpa2对胆囊癌细胞的抑制作用被逆转。此外，流式细胞术和荧光染色结果显示，Hpa2促进了细胞凋亡和活性氧(ROS)的产生。研究人员还通过CHEA3平台预测了35个Hpa2与VEGF可能共同作用的转录因子。

3.4 硫酸肝素酶2抑制胆囊癌细胞的成瘤能力

裸鼠成瘤实验显示，NOZ-Hpa2细胞形成的移植瘤体积明显小于正常NOZ细胞组。组织病理学分析发现，NOZ-Hpa2组肿瘤内新生血管减少，血管由单层扁平细胞排列而成。免疫组织化学结果显示，NOZ-Hpa2肿瘤中CD31、VEGFC和VEGFR2的表达水平较低。当给予Mersalyl干预后，Hpa2过表达对肿瘤生长和血管生成的抑制作用被削弱。

本研究的重要发现在于首次系统阐述了Hpa2在胆囊癌中的抑癌作用及其分子机制。与已知促进肿瘤发展的Hpa1不同，Hpa2通过抑制VEGF/VEGFR信号通路，显著减弱了胆囊癌细胞的恶性表型。这一发现不仅拓展了我们对硫酸肝素酶家族功能多样性的认识，也为胆囊癌的靶向治疗提供了新的方向。

研究还发现Hpa2能够促进细胞凋亡和活性氧产生，这可能与内质网应激反应有关。这一发现与某些研究者的观点一致，即Hpa2可能通过增强内质网应激反应，导致细胞凋亡增加和生长抑制。然而，研究人员也指出，本研究尚未探讨不同胆囊癌细胞系中Hpa2的基础表达水平，以及Hpa2敲除对胆囊癌细胞生物学功能的影响，这些将是未来研究的重要方向。

从临床转化角度而言，VEGF/VEGFR通路是已知的血管生成相关信号通路，针对该通路的抑制剂如贝伐珠单抗(Avastin)已用于转移性结直肠癌和非小细胞肺癌的辅助治疗。本研究将Hpa2与该通路联系起来，为开发新的治疗策略提供了理论依据。特别是当使用VEGF/VEGFR通路激动剂处理后，Hpa2的抑癌作用被逆转，这一结果进一步证实了二者之间的因果关系。

值得注意的是，VEGF与硫酸肝素酶之间的关系可能涉及翻译后修饰(PTMs)的调控，特别是乙酰化作用。乙酰化作为一种可逆的赖氨酸残基修饰，可能影响硫酸肝素酶的酶活性，从而调节VEGF从细胞外基质(ECM)中的释放。虽然本研究未深入探讨这一机制，但这为理解Hpa2如何调控VEGF可用性提供了新的视角。

综上所述，本研究通过一系列实验证据表明，Hpa2通过调控VEGF/VEGFR通路抑制胆囊癌的生长，同时促进细胞凋亡和活性氧产生。这些发现不仅深化了对胆囊癌发病机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。未来的研究需要进一步阐明Hpa2调控VEGF信号通路的具体分子机制，以及其在胆囊癌治疗中的临床应用价值。