印度西孟加拉邦大片形吸虫基于线粒体cox1与nad1基因的分子鉴定及系统发育分析

《Tropical Animal Health and Production》：Molecular characterization and phylogenetic analysis of Fasciola gigantica from West Bengal, India using mitochondrial DNA (cox1 and nad1) as markers

本研究针对印度西孟加拉邦牛和水牛源大片形吸虫（Fasciola gigantica）的精准鉴定需求，研究人员通过线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（cox1）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1（nad1）基因标记进行分子表征。结果显示所有样本均聚类于F. gigantica进化枝，种内序列高度保守，种间存在特异性位点差异，首次证实该地区流行株为F. gigantica，为寄生虫溯源和防控提供分子依据。

　　

通过分子手段对大片形吸虫（Fasciola）进行鉴定和表征已成为当前趋势，这种技术比形态学鉴定更为可靠。基于此，本研究旨在利用线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（cox1）和线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1（nad1）作为分子标记，对来自印度西孟加拉邦牛和水牛的大片形吸虫（Fasciola gigantica）进行分子表征。

首先根据形态学初步鉴定了24只吸虫。从这些吸虫中提取基因组DNA，并使用特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR），分别扩增从屠宰牛和水牛的肝脏及胆管收集的成虫线粒体cox1和nad1区域的180 bp和520 bp片段。随后对扩增产物进行测序并分析序列数据。

PCR、多序列比对和系统发育树重建均证实了西孟加拉邦地区存在F. gigantica吸虫。所有当前的大片形吸虫序列在系统发育上，无论是cox1还是nad1区域，都聚集在F. gigantica进化枝中，其外类群为卫氏并殖吸虫（Paragonimus westermanii）（GenBank登录号：AY190066和AF051840）。

实验样本的种内多序列分析显示，线粒体cox1和nad1区域均未出现核苷酸位点变异。另一方面，种间多序列分析揭示了与GenBank中其他F. gigantica序列相比，在cox1和nad1区域均存在五个碱基替换。同样，种内氨基酸比对显示，当前实验的大片形吸虫在cox1和nad1区域均未出现氨基酸位点变异。此外，种间氨基酸序列分析显示，西孟加拉邦分离株与其他不同分离株的F. gigantica相比，在线粒体cox1区域存在一个氨基酸序列多态性，在线粒体nad1区域存在三个氨基酸序列多态性。

本研究揭示了在线粒体cox1和nad1区域存在高度的种特异性同源性。多序列比对也揭示了显著的相似性位点，这些位点也可用于鉴定F. gigantica。所有测序的西孟加拉邦分离株均被鉴定为F. gigantica，序列分析还揭示了印度西孟加拉邦分离株与其他国家分离株之间的亲缘关系。

p-距离比较显示，从西孟加拉邦牛和水牛分离的F. gigantica序列，其线粒体cox1基因的差异值范围在0.000至0.742之间，而nad1基因的差异值为0.000–0.000。这是首次使用线粒体cox1和nad1作为分子标记，对印度西孟加拉邦牛和水牛源F. gigantica分离株进行分子鉴定的报告。基于多序列分析、系统发育树分析和低水平遗传p-距离研究的结果表明，在相对限定的地理区域内，宿主差异可能不是导致F. gigantica遗传差异的有效特征。