综述：CRISPR-Cas作为强大基因编辑工具开启抗菌治疗新纪元

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：CRISPR-Cas opens a new era of antimicrobial therapy as a powerful gene editing tool

本文系统阐述了CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白）技术在应对抗菌素耐药性（AMR）方面的前沿进展。作者指出，该技术凭借其高效、精准的基因编辑能力，可特异性靶向耐药基因，精准清除病原菌而不影响正常菌群。同时，文章还探讨了如何利用CRISPR-Cas技术改造噬菌体（Bacteriophages），以增强其杀菌特性，为开发新型抗菌策略提供了双重路径。

　　

Abstract

抗菌素耐药性（AMR）的出现以及新型抗生素研发进程的缓慢，导致细菌感染引起的死亡率上升，对全球人类健康构成重大威胁。因此，迫切需要开发新型抗菌剂以补充或替代抗生素。成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白（CRISPR-Cas）技术，凭借其强大而高效的基因编辑能力，已成为对抗AMR的一种有前景的新型抗菌剂。CRISPR-Cas系统可以通过多种方式递送到细菌内部，靶向特定基因，以高精度杀死细菌，且不影响正常菌群。噬菌体是另一种有前景的抗菌剂，因其具有特异性的杀菌作用。CRISPR-Cas技术还可用于编辑噬菌体基因组，改变噬菌体特性，包括解决噬菌体治疗应用的局限性，例如扩大宿主范围和增强杀菌特性。本文总结了不同CRISPR系统的组成和作用机制、递送CRISPR系统的载体及其优势和局限性。并概述了CRISPR-Cas系统在对抗抗菌素耐药性和增强噬菌体杀菌特性方面应用的最新进展。

CRISPR-Cas系统的组成与作用机制

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种适应性免疫系统，现已被开发为高效的基因编辑工具。该系统主要由两部分组成：CRISPR序列（负责识别特定DNA片段）和Cas蛋白（具有切割DNA的功能）。根据效应蛋白复合物的差异，CRISPR-Cas系统主要分为两大类。Class 1系统（如Type I和Type III）使用多亚基效应复合物来切割靶核酸，而Class 2系统（如Type II, Type V, Type VI）使用单个效应蛋白（如Cas9, Cas12, Cas13），这使得其更易于应用于基因编辑。其中，最广泛使用的是CRISPR-Cas9系统。其作用机制简而言之是：向导RNA（gRNA）与Cas蛋白结合形成复合物，gRNA通过碱基互补配对原则识别并结合到靶基因的特定位点，随后Cas蛋白对DNA双链进行切割，引发DNA修复机制，从而实现基因敲除、插入或修复等编辑操作。这种精准靶向的能力，使其在对抗携带特定耐药基因的细菌时极具潜力。

CRISPR-Cas系统的递送载体

将CRISPR-Cas系统有效递送至目标细菌细胞内是发挥其抗菌作用的关键挑战。目前的研究探索了多种递送策略，各有其优缺点。一种主要策略是利用噬菌体作为载体，即构建“噬菌体-CRISPR”系统。改造后的噬菌体可以感染特定细菌，并将其携带的CRISPR-Cas系统“注射”到细菌内部，从而精准杀伤耐药菌。另一种策略是使用质粒或纳米颗粒等非病毒载体。例如，阳离子聚合物或脂质纳米颗粒可以包裹编码CRISPR-Cas系统的质粒DNA，并通过细菌的内化作用进入细胞。此外，接合质粒也被用于递送，它能够通过细菌间的直接接触（接合作用）在不同菌株间转移CRISPR系统。每种递送方式都面临效率、特异性、宿主范围以及潜在免疫原性等挑战，优化递送系统是当前研究的热点之一。

CRISPR-Cas在对抗抗菌素耐药性（AMR）中的应用

CRISPR-Cas技术对抗AMR的核心优势在于其“精准打击”能力。与传统抗生素广谱杀菌、易破坏正常菌群不同，CRISPR-Cas系统可以被设计成特异性靶向细菌的必需基因或耐药基因。例如，针对携带NDM-1（新德里金属β-内酰胺酶-1）基因的“超级细菌”，可以设计特定的gRNA引导Cas蛋白切割ndm-1基因，从而消除其耐药性，使细菌重新对常规抗生素敏感。或者，直接靶向细菌生存所必需的基因（如管家基因），导致细菌死亡。这种策略被称为“基因驱动杀菌”或“序列特异性抗菌剂”。研究表明，在体外和小鼠模型中，CRISPR-Cas系统能够有效清除多种耐药病原体，如金黄色葡萄球菌（MRSA）、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等，且对周围共生微生物影响极小，有望解决现有抗生素疗法导致的菌群失调问题。

CRISPR-Cas技术在噬菌体疗法中的增强作用

噬菌体疗法是另一种应对AMR的有力候选方案，但其应用存在一些局限性，如宿主范围窄、细菌易对噬菌体产生抗性等。CRISPR-Cas技术恰好可以用于优化和增强噬菌体的治疗性能。研究人员可以利用CRISPR-Cas基因编辑技术对噬菌体基因组进行精确修饰。例如，通过编辑噬菌体的尾丝蛋白基因，可以改变其识别宿主菌表面受体的特性，从而扩大其可感染的细菌种类（即扩大宿主范围）。此外，还可以将编码特定裂解酶或抗菌肽的基因整合到噬菌体基因组中，使其在感染细菌后不仅能自身复制裂解细菌，还能表达额外的杀菌因子，增强杀菌效果（即增强溶菌特性）。更为巧妙的是，可以构建一种“智能”噬菌体，其基因组中整合了针对细菌耐药基因的CRISPR-Cas系统。当这种改造后的噬菌体感染细菌时，它既可以通过自身的溶菌周期杀死细菌，又能将CRISPR-Cas系统导入细菌细胞内，靶向清除耐药基因，实现双重杀菌机制，并减少细菌耐药性产生的风险。

挑战与展望

尽管CRISPR-Cas技术在抗菌治疗领域展现出巨大潜力，但其走向临床转化仍面临诸多挑战。首要问题是递送效率和在复杂体内环境（如生物被膜内）中的有效性。其次，细菌可能通过突变gRNA的靶序列来逃逸CRISPR-Cas系统的攻击，因此可能需要设计多重gRNA同时靶向多个基因位点。此外，安全性问题也不容忽视，例如脱靶效应（意外切割非目标基因）以及可能引发的宿主免疫反应等。未来的研究方向将集中在开发更安全、高效且具有广谱适用性的递送系统，优化CRISPR系统本身以提高其特异性和活性，并探索其与抗生素或噬菌体疗法的联合应用策略。总之，CRISPR-Cas技术为应对日益严峻的AMR危机开辟了一条充满希望的新途径，通过精准编辑生命的基本蓝图，有望革命性地改变我们对抗病原菌的方式。