外源烟酰胺通过NADP(H)库扩增、光合电子传递恢复和抗氧化系统激活增强辣椒镉耐受性

《Scientia Horticulturae》：Exogenous niacin enhances Cd tolerance in pepper via NADP(H) pool expansion, photosynthetic electron transport recovery and antioxidant system activation

本研究针对农业土壤镉污染严重威胁作物生产力和食品安全的问题，探讨了外源烟酰胺(NAC)缓解辣椒镉毒性的机制。研究发现NAC通过激活NAD+补救途径增强NADP(H)库，恢复光合电子传递链功能，并强化抗氧化防御系统，显著提高了辣椒的镉耐受性。该研究为重金属污染土壤中的作物保护提供了新的分子见解和应用策略。

　　

随着工业化和城市化的快速发展，土壤重金属污染已成为全球性的环境挑战。镉(Cd)作为最具毒性的重金属之一，在土壤中具有高迁移性，能够通过作物吸收进入食物链，严重威胁人类健康。国际癌症研究机构(IARC)已将镉列为1类致癌物。在中国，农田重金属污染已达到惊人水平，约1000万公顷农田受到污染，其中333万公顷已不再适合耕种。

面对不断增长的粮食需求和有限的耕地资源，农业不得不向边际区域扩展，包括金属污染土壤。在这些土壤中，镉通过根系被植物吸收，利用与必需营养素相同的膜转运蛋白进入植物细胞，不仅破坏了营养吸收，还引发了一系列复杂的毒性反应。镉干扰细胞稳态，诱导基因表达谱的重大重编程，影响氧化还原调节、能量代谢和信号传导等多个关键生理途径。

在镉的多种毒性效应中，其对光合作用的影响尤为值得关注，因为这一过程决定了植物生长和生物量积累。光合机构特别容易受到镉胁迫的影响：即使低浓度的镉也能破坏叶绿素合成，损害电子传递链，显著减少NADPH和ATP的产生，进而影响碳同化和其他必需代谢过程。

近年来，研究表明烟酰胺(NAC)作为NAD⁺和NADP⁺的前体，可能帮助植物应对氧化应激。几项报告显示，外源烟酰胺应用增强了植物对各种重金属的耐受性，但其保护机制因金属类型和植物种类而异。辣椒作为全球重要的园艺作物，具有高营养和药用价值，但在中国主要产区却面临严重的镉污染问题。

为此，研究人员开展了外源烟酰胺增强辣椒镉耐受性的机制研究，论文发表在《Scientia Horticulturae》上。为了探究这一问题，研究人员采用了多种关键技术方法：通过水培实验评估不同浓度NAC对镉胁迫下辣椒生长的影响；使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定叶片镉含量；利用便携式红外气体交换系统和双调制叶绿素荧光成像系统测量气体交换参数和叶绿素荧光参数；通过生化分析方法测定MDA、H₂O₂含量和抗氧化酶活性；采用转录组学和代谢组学技术分析基因表达和代谢物变化；使用实时定量PCR(qRT-PCR)验证RNA测序结果。

3.1. 外源NAC缓解Cd诱导的辣椒生长和光合作用抑制

剂量反应实验表明，镉胁迫降低了气孔导度和细胞间CO₂浓度，导致净光合速率(Pn)比对照组降低20.7%。外源应用低浓度(200 mg/L)NAC部分恢复了镉胁迫下辣椒叶片的Pn，而较高浓度则消除了这种改善效果。单镉处理导致辣椒叶片中镉高度富集，植物生长明显抑制，生物量积累显著减少。Cd+NAC1处理使叶片镉含量降低12.9%，生物量积累比单镉处理增加82.8%。

3.2. 外源NAC应用增加镉胁迫下辣椒叶片的光合能力

镉胁迫处理后，约65.2%的PSI复合物(P700)受到抑制，伴随着PSI供体侧限制[Y(ND)]和受体侧限制[Y(NA)]的显著增加。这些限制导致PSI量子产率[Y(I)]和电子传递速率[ETR(I)]较对照条件显著降低。与单镉处理相比，Cd+NAC1处理部分恢复了Y(I)和ETR(I)，同时显著降低了Y(NA)。研究人员进一步通过同时测量质体蓝素(PC)和铁氧还蛋白(Fd)的氧化还原变化来监测PSI电子供体和电子受体的变化。单镉处理期间，PC_m和Fd_m分别降至对照组的25.2%和28.1%。Cd+NAC1处理将Fd_m恢复至对照组的57.2%，PC_m仅恢复至对照组的43.4%。

PSII活性和电子传输效率也受到镉胁迫的负面影响。镉胁迫下，光诱导调节性非光化学淬灭量子产率[Y(NPQ)]显著下降，而组成性非调节性非光化学淬灭量子产率[Y(NO)]显著增加。这种能量耗散模式的转变导致PSII量子产率[Y(II)]和电子传递速率[ETR(II)]较对照条件显著降低。然而，Cd+NAC1处理有效缓解了镉胁迫诱导的有害效应。

研究人员随后评估了外源NAC对镉胁迫下CO₂同化效率的影响。镉胁迫显著降低了Pn_max、Vc_max和J_max，而Cd+NAC1处理阻止了这种负面影响。

3.3. 外源NAC应用缓解Cd诱导的辣椒叶片氧化损伤

单镉处理导致辣椒叶片H₂O₂含量显著增加，MDA含量比对照条件增加133.4%。Cd+NAC1处理显著降低了H₂O₂和MDA水平，同时显著提高了辣椒叶片的总抗氧化能力(T-AOC)。与对照组相比，单镉处理显著降低了叶片中CAT、POD和GR活性，尽管H₂O₂水平升高，表明镉通过蛋白质损伤和转录抑制直接损害这些抗氧化酶。相比之下，SOD活性较对照组显著促进。与单镉处理相比，Cd+NAC1处理显著提高了辣椒叶片中POD、CAT和APX活性。

3.4. 光合作用和氧化还原稳态相关基因表达的变化

转录组分析显示，主成分分析(PCA)结果揭示了单镉处理样品与其他组的明显分离，而对照组和Cd+NAC1处理组没有显著分离。根据筛选标准，在比较组Cd/CON、Cd/Cd+NAC1和CON/Cd+NAC1中分别鉴定出2800、3450和237个差异表达基因(DEGs)。

为了研究NAC缓解镉毒性的潜在通路，进行了基因集富集分析(GSEA)以识别比较组中的差异KEGG通路。结果揭示了在CON/Cd、Cd+NAC1/Cd比较组中分别显著富集了44和47个KEGG通路。这些KEGG通路主要与光合作用、氧化还原稳态、氨基酸合成和降解以及蛋白质合成相关。特别是，光合作用通路在单镉处理中明显抑制，而在Cd+NAC1处理中被激活。

研究人员还鉴定了几种参与氧化还原稳态调节的基因，主要包括四个金属硫蛋白编码基因、四个超氧化物歧化酶编码基因、两个过氧化物酶编码基因、一个过氧化还原蛋白编码基因、两个谷胱甘肽过氧化物酶编码基因、三个谷胱甘肽硫转移酶编码基因、五个硫氧还蛋白编码基因和三个谷胱甘肽还原酶编码基因。这些酶有助于在细胞内建立强大的抗氧化系统， notably涉及ASA-GSH系统和铁氧还蛋白-硫氧还蛋白调节网络，调节叶绿体内的氧化还原稳态。

3.5. 转录组和代谢组的联合分析确定了缓解Cd毒性的潜在代谢途径

非靶向代谢组学分析共鉴定和定量了所有样品中的3771种代谢物。PCA显示对照组、单镉处理和Cd+NAC1处理之间存在明显分离，表明镉诱导的毒性改变了辣椒叶片的代谢谱，外源NAC部分恢复了镉胁迫下的代谢景观。根据筛选标准，在比较组CON/Cd和Cd/Cd+NAC1中分别鉴定出2278和2357个差异代谢物(DAM)。大多数DAM属于有机氧化合物、脂质、羧酸及其衍生物以及黄酮类化合物。

为了进一步阐明NAC介导的镉解毒代谢机制，将来自两个比较组的DEGs和DAMs同时映射到KEGG数据库，并保留共享的KEGG通路。结果揭示了在CON/Cd和Cd/Cd+NAC1比较组中分别显著富集了23和22个共享KEGG通路。在这些通路中，14个通路在两个比较组中显著富集。值得注意的是，许多通路是应激和免疫反应相关通路，如花生四烯酸代谢、硫代谢、黄酮类生物合成、核黄素代谢、谷胱甘肽代谢以及烟酸和烟酰胺代谢。

3.6. 外源NAC应用在转录组和代谢组水平上诱导吡啶核苷酸及其衍生物、谷胱甘肽和核黄素的生物合成

在烟酸和烟酰胺代谢途径中，镉和外源NAC影响了参与NAD(P)生物合成的四个酶编码基因的表达水平。具体来说，编码5′-核苷酸酶(EC:3.1.3.5)、尿苷核苷酶(EC:3.2.2.3)和NAD⁺激酶(EC:2.7.1.23)的基因在单镉处理下显著下调，而Cd+NAC1处理缓解了这种负面影响。值得注意的是，Cd+NAC1处理显著增强了编码NAD⁺合成酶(EC:6.3.1.5)的基因的表达水平。

在核黄素生物合成途径中，镉和外源NAC影响了参与核黄素及其衍生物生物合成的四个酶编码基因的表达。编码核黄素合成酶(EC:2.5.1.9)、核黄素激酶(EC:2.7.1.26)、FMN水解酶(EC:3.1.3.102)和抗酒石酸酸性磷酸酶5型(ACP5, EC:3.1.3.2)的基因在单镉处理下显著下调，而Cd+NAC1处理阻止了这种负面影响。

在谷胱甘肽代谢途径中，参与谷胱甘肽(GSH)生物合成的三个酶编码基因，如氨肽酶N(PepN)、亮氨酰氨肽酶(PepA)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)，在单镉处理下下调。相比之下，Cd+NAC1处理上调了这些基因的表达，并增强了抗坏血酸(ASA)和GSH的积累。

3.7. 鉴定与NAC介导的镉胁迫下光合能力相关的潜在代谢物和基因

Mantel分析结果显示，光合参数与烟酰胺、NaND、NAD⁺、NADPH、FAD、还原核黄素、GSH和ASA含量之间存在显著相关性。同时，H₂O₂和MDA含量与烟酰胺、NaND、NAD⁺、NADPH、FAD、还原核黄素、GSH和ASA含量呈显著负相关。这些结果表明，烟酰胺、NAD⁺、NADPH、FAD、还原核黄素和GSH，特别是NAD⁺和还原核黄素，在缓解氧化应激和保护镉胁迫下辣椒叶片光合作用中起着关键作用。

此外，研究人员进行了关键代谢物及其相关基因的共表达网络分析。GSH含量与编码GST、谷胱甘肽过氧化物酶和亮氨酰氨肽酶的基因表达水平呈正相关。

在核黄素生物合成途径中，还原核黄素含量与编码核黄素合成酶(Caz07g16490)和酸性磷酸酶(Caz03g14630)的基因表达水平呈正相关。FAD含量与编码核黄素合成酶(Caz07g16530)、酸性磷酸酶(Caz03g14630)、核黄素激酶(Caz07g18120)和FMN水解酶(Caz05g22360)的基因表达水平呈正相关。

在烟酸和烟酰胺代谢途径中，烟酰胺和Deamino-NAD⁺含量与编码尿苷核苷酶(Caz09g22480, Caz12g04760)的基因表达水平呈正相关，NAD⁺含量与编码尿苷核苷酶(Caz12g04760)和5′-核苷酸酶(Caz04g03100)的基因表达水平呈正相关。

研究结论表明，外源烟酰胺通过多种机制增强辣椒的镉耐受性。最重要的是，研究发现NAD⁺补救途径在NAC增强的应激耐受性中起着核心作用。NAC上调了该途径中的关键基因，包括编码5′-核苷酸酶、尿苷核苷酶和NAD⁺合成酶的基因，导致增加的NAD(P)⁺库，支持电子传递和氧化还原平衡。此外，NAC激活了参与核黄素代谢和黄素合成的基因，为电子传递链提供了额外支持。

这些发现揭示了NAC保护作用的分子基础，并表明其在改善金属污染土壤上作物表现的潜在应用。该研究不仅为理解植物重金属胁迫响应机制提供了新的见解，还为开发可持续的农业保护策略提供了重要理论基础。基于剂量反应优化，研究人员推荐对镉胁迫下的辣椒植物叶面喷施200 mg/L NAC，可能适用于其他具有类似NAD(P)⁺代谢途径的茄科作物。然而，在更广泛的农业实施之前，需要在多样化环境条件下进行田间规模的验证。