基于化学发光共振能量转移(CRET)的电化学发光磁性生物传感器用于microRNA与甲状旁腺激素同步检测及其在甲状腺疾病诊断中的应用

《Sensors and Actuators Reports》：Electrochemiluminescent magnetic biosensor for simultaneous microRNA and parathyroid hormone detection via resonance energy transfer

本研究针对甲状腺相关恶性肿瘤诊断中缺乏可同时检测microRNA（miR）与蛋白质标志物的技术难题，开发了一种新型电化学发光(ECL)磁性生物传感器。该传感器利用化学发光共振能量转移(CRET)机制，实现了对miR-222和甲状旁腺激素(PTH)的高灵敏度同步检测，在血清中检测限分别达到0.38 fM和0.22 pg/mL，为甲状腺癌和甲状旁腺功能障碍的即时检测提供了创新解决方案。

　　

甲状腺相关恶性肿瘤通常涉及致癌基因改变和内分泌失衡的双重病理机制，需要同时对多种生物标志物进行监测。然而，现有的诊断平台无法在单一血液样本中实现microRNA和蛋白质标志物的同步检测，更难以满足实时或床旁检测的临床需求。这种技术局限严重制约了甲状腺疾病的早期诊断和精准治疗。

为了解决这一难题，来自长庚大学化学与材料工程系的研究团队在《Sensors and Actuators Reports》上发表了一项创新研究，开发了一种基于电化学发光(ECL)技术的磁性生物传感器，能够同时检测microRNA-222（miR-222）和甲状旁腺激素（PTH）这两种与甲状腺癌和甲状旁腺功能障碍密切相关的临床指标。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过电化学方法合成磁性纳米粒子（MNP）并利用L-苯丙氨酸（LPA）进行表面功能化；构建了基于化学发光共振能量转移（CRET）的检测体系，使用luminol作为能量供体，有机染料作为能量受体；采用人血清样本进行方法验证；通过差分脉冲伏安法（DPV）和方波伏安法（SWV）进行电化学检测。

研究结果方面，在"3.1. 电合成参数优化"部分，研究人员系统优化了电化学合成参数，包括电解质浓度/组成、初始pH、阴极材料和电流密度等，发现石墨是最佳阴极材料，最佳电流密度为26.04 mA/cm2，最佳反应时间为30分钟，Na₂SO₄浓度为0.15M，初始pH为8.0，H₂O₂浓度为0.0196M。

在"3.2. 结构与热分析"部分，通过X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）和拉曼光谱等多种表征手段，证实了LPA成功修饰在MNP表面，LPA-MNP复合物保留了各组分的特征结构。

在"3.3. MNP电化学合成机理与表面化学"部分，研究人员详细阐述了电化学合成MNP的原理和机制，包括阳极铁氧化生成铁离子、阴极还原反应生成氢氧根离子等过程，并指出碱性条件对成功合成至关重要。

在"3.4. L-苯丙氨酸的表面功能化与吸附动力学"部分，研究表明LPA在MNP上的吸附符合Langmuir模型，表明是单层吸附，最高吸附容量在45°C时达到1.469 mg/mg，吸附过程是自发和放热的。

在"3.6. LPA-MNP的微观结构与粒径分布分析"部分，透射电子显微镜（TEM）分析显示，原始MNP的平均粒径约为50 nm，经LPA修饰后增加到70 nm，但整体形貌保持一致，证实了成功的表面功能化。

在"3.7. 蛋白质（PTH）和miRNA-222的单目标ECL分析"部分，研究人员记录了miRNA-222和PTH的ECL响应，使用luminol作为供体，在H₂O₂和HRP存在下，阳极氧化在～250 mV触发luminol发射（～425 nm），激活与Pacific Blue（PB）和Fluorescein（FL）受体的CRET，分别在465 nm（miRNA-222）和525 nm（PTH）产生发射。

在"3.8. 通过ECL同时检测蛋白质（PTH）和miRNA-222"部分，双目标ECL生物传感器的分析性能在PBS和人血清中进行了评估，miRNA-222用Pacific Blue（PB）标记，PTH用Fluorescein（FL）标记。ECL信号在465 nm（对应miRNA-222）和525 nm（对应PTH）处随着目标物浓度的增加而增加，miRNA-222的检测范围为1-1000 fM，PTH的检测范围为10⁰-10⁵ pg/mL。

在"3.9. 使用LPA-MNP生物传感器对miRNA-222和PTH进行电化学检测"部分，采用SHRP-based sandwich immunoassay方法进行电化学检测，峰值电流随着miRNA-222和PTH浓度的增加而增加，显示出强烈的剂量-反应关系。EC LOD对于miR-222和PTH在人血清中分别为0.029 fM和0.032 pg/mL，在PBS中分别为0.039 fM和0.051 pg/mL。

在"3.10. 稳定性与选择性"部分，LPA-MNP生物传感器在4°C下70天内表现出优异的稳定性，两种检测的信号损失最小（≤12%）。使用非互补序列进行的选择性评估显示可忽略的ECL和电化学响应，证实了高特异性。

在"3.11. ECL测量的优化"部分，研究人员系统优化了关键实验参数，包括探针浓度和封闭条件，确定miR-222的最佳Cp/Dp探针浓度为0.5 μM，PTH检测的最佳Ab₂浓度为0.4 μg/mL，最佳BSA浓度为3%。

研究结论表明，该研究成功开发了一种新型电化学发光（ECL）生物传感器平台，用于同时检测miR-222和PTH这两种与甲状腺相关疾病密切相关的生物标志物。该生物传感器采用功能化磁性纳米粒子（MNP），通过简单、绿色的电化学方法合成，使用无毒盐、可回收电极和温和反应条件，最大限度地减少了环境影响。通过集成基于luminol的CRET信号传导，传感器实现了优异的分析性能，检测在30分钟内快速完成。在SWV中获得了极低的检测限，miR-222为0.029 fM，PTH为0.032 pg/mL；在ECL中分别为0.38 fM和0.22 pg/mL。这种绿色、高性能的生物传感器在临床即时诊断和早期检测策略方面具有广阔前景。

讨论部分强调，该研究的创新性在于首次成功实现了对核酸和蛋白质目标物的多重ECL检测，为甲状腺相关疾病诊断提供了同时定量检测miR-222和PTH的定制化解决方案。与文献中报道的其他生物传感器相比，本研究开发的传感器在检测灵敏度、多重检测能力和实际应用性方面表现出明显优势。磁性纳米粒子的使用不仅实现了目标物的高效富集，还提供了信号放大功能，大大提高了检测灵敏度。CRET机制的应用避免了激发光的使用，有效降低了背景干扰，提高了信噪比。这种技术平台为未来开发更多生物标志物的同步检测提供了重要技术基础，在精准医疗和个性化治疗领域具有重要的应用价值。