基于DCIP-Biotin探针的FAP激活型近红外荧光成像技术及其在乳腺癌精准手术导航中的应用研究

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Highly Selective Room Temperature NO 2 Detection via π-Back Bonding in CuTPP-Functionalized Conductive Polymer Sensors

本文开发了一种新型肿瘤靶向近红外荧光探针DCIP-Biotin，通过特异性激活机制实现对纤维细胞激活蛋白（FAP）的高灵敏度检测（线性范围宽、灵敏度达6.76 ng/mL），成功应用于乳腺癌细胞、荷瘤小鼠及人体组织样本的荧光成像，为乳腺癌术中导航和精准切除提供突破性技术方案。

　　

亮点

本研究设计了一种靶向肿瘤的近红外（NIR）荧光探针DCIP-Biotin，用于检测人乳腺癌细胞、荷瘤小鼠和人体乳腺癌组织样本中的纤维细胞激活蛋白（FAP）活性。该探针将新型近红外荧光团（二氰基异佛尔酮）与FAP识别底物连接，并标记生物素标签，展现出宽线性范围、高灵敏度、良好选择性和强抗干扰能力。当FAP存在时，DCIP-Biotin可在660 nm波长处被特异性激活，实现对FAP表达细胞的高效识别与成像。在MDA-MB-231荷瘤小鼠和人体乳腺癌组织中，该探针表现出卓越的荧光成像性能：高特异性、高肿瘤背景比、深组织穿透性和稳定荧光信号。其优异性能可实现乳腺癌与癌旁组织的清晰区分，在术中导航领域具有重大应用潜力。

引言

尽管乳腺癌的早期诊断和治疗手段不断进步，它仍是女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。当前治疗策略包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗等。超过90%的乳腺癌在确诊时尚未转移，非转移性乳腺癌的治疗目标在于彻底清除肿瘤并预防复发。目前术中病灶切除完整性评估主要依赖外科医生经验和术前影像学，缺乏客观的术中评估手段，因此开发光学探针对乳腺癌精准切除至关重要。

作为Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，纤维细胞激活蛋白（FAP）具有二肽酶和内肽酶活性。其可溶性形式能水解甘氨酸-脯氨酸（Gly-Pro）肽链，在人类血浆中浓度约为100 ng/mL（0.6 nM）。FAP主要表达于癌症相关成纤维细胞（CAFs）亚群，并在乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌和胰腺癌中过度表达。研究表明FAP是乳腺癌细胞侵袭和转移的关键因子，其敲低可逆转上皮-间质转化（EMT）并抑制肿瘤转移。蛋白质组学分析提示FAP可作为三阴性乳腺癌免疫治疗反应的预测生物标志物。因此开发灵敏的分子探针用于原位检测FAP活性，对乳腺癌的早期诊断、精准切除、进展监测和疗效预测具有重要意义。

当前FAP检测方法包括逆转录PCR、蛋白质印迹、免疫组化、同位素标记底物技术、蛋白质组学、FAPI-PET/CT和光学探针等。其中小分子荧光探针因具备高灵敏度、无创性、实时成像和时空分辨率高等优势而备受关注。酶激活型荧光探针尤其适用于检测代谢过程中低丰度的靶酶。近年来已有少量FAP荧光探针报道，例如Miao团队开发的近红外探针可实现2×10?个瘢痕疙瘩细胞的检测限；基于花青染料（Cy）的探针可通过识别FAP⁺ CAFs有效检测肝细胞癌病灶。然而现有探针多数缺乏肿瘤靶向识别基团，难以满足临床术中精准导航需求。本研究开发的DCIP-Biotin探针具有更宽线性范围和高灵敏度（rhFAP检测限6.76 ng/mL；MDA-MB-468细胞检测限5.61×103 cells/mL），在活细胞、荷瘤小鼠和人体乳腺癌组织中均表现出优异性能，其对于二肽基肽酶Ⅳ（DDP-Ⅳ）的选择性远高于既往探针（详见表S1）。

如方案1所示，该探针由近红外荧光团（DCIP）、FAP识别底物和生物素标签组成。当探针抵达肿瘤部位时，生物素标签可靶向生物素受体阳性肿瘤细胞并增强肿瘤组织摄取。在FAP作用下，游离荧光团被释放并激活近红外荧光，最终实现MDA-MB-468肿瘤球体、荷瘤小鼠和人体乳腺癌组织中FAP活性的原位成像。该技术可清晰区分乳腺癌与正常组织边界，为术中肿瘤切除提供精准导航，在乳腺癌进展监测、预后评估和疗效预测方面具有广阔应用前景。

实验流程

实验详细流程包括试剂、仪器、实验方法、表征和检测方法等均列于支持信息中。

设计与合成

新型荧光团DCIP结构简单且易于制备，其具备典型分子内电荷转移（ICT）过程和大π共轭体系，发射波长可达近红外区域。DCIP-Biotin的合成路线如方案S1所示：首先以2-Cl(Trt)-Cl树脂为固相肽合成载体制备FAP识别底物连接生物素标签（GP-Biotin），随后通过...

结论

我们成功开发了新型FAP激活近红外荧光探针DCIP-Biotin，该探针具备高灵敏度、良好选择性、强抗干扰能力和宽线性范围等优势。生物素标签的引入实现了肿瘤细胞靶向识别并增强肿瘤部位聚集效应。在荷瘤小鼠和人体乳腺癌组织中的卓越成像性能表明，该探针可为术中导航和肿瘤切除提供关键技术支持。