揭示长链非编码RNA PIG13-DT通过YBX3/USP15轴促进肝细胞癌恶性进展的分子机制及其临床意义

《Cancer Biology & Therapy》：Unveiling the oncogenic role of lncRNA PIG13-DT in hepatocellular carcinoma progression

本研究首次系统阐明了lncRNA PIG13-DT在肝细胞癌（HCC）中的致癌作用，发现其通过结合RNA结合蛋白YBX3增强USP15 mRNA稳定性，进而激活癌症干细胞功能、抑制ROS生成与凋亡，促进HCC增殖转移。该轴心与不良预后显著相关，为HCC诊断生物标志物和靶向治疗提供了新策略。

　　

引言

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，其发病率呈持续上升趋势。超过80%的患者在确诊时已处于不可手术的晚期阶段，面临巨大的未满足医疗需求。尽管近年来HCC的诊断和治疗取得了显著进展，但不可切除HCC患者的预后仍然极差。非编码RNA（ncRNAs）作为不编码蛋白质的基因组转录本，在癌症发生发展中起关键调控作用。其中长度超过200个核苷酸的转录本被定义为长链非编码RNA（lncRNAs），如HOTAIR、PCAT1和PVT1等已被证实在肺癌发生中发挥重要作用。大量研究强调了lncRNAs在HCC中的重要意义，但C1orf21-DT（PIG13-DT）在肿瘤中的作用尚不明确。

Y盒结合蛋白3（YBX3）作为RNA结合蛋白，在肝脏疾病发生发展中起关键作用，与乙型肝炎病毒（HBV）相关HCC的发展进展密切相关，可能是预后不良的潜在生物标志物。研究证实YBX3表达失调与HCC患者总生存期（OS）呈负相关，且是HCC免疫逃逸、肝缺血再灌注损伤和肝干细胞异常分化的关键介质。泛素特异性加工蛋白酶15（USP15）通过去泛素化关键靶蛋白调控多种细胞过程，最近研究表明USP15在HCC肿瘤组织中表达升高，与转移和不良预后密切相关。

结果

LncRNA PIG13-DT在HCC肿瘤组织中上调并与不良预后相关

为识别可能导致HCC肿瘤进展的潜在lncRNA，研究人员分析了7对根据总生存期（OS）分为良好预后和不良预后组的HCC患者的lncRNA转录谱。结果显示，在预后不良患者中有更多lncRNAs高表达，其中PIG13-DT在预后不良患者中的表达比良好预后患者高八倍。同时观察到PIG13-DT与其宿主基因PIG13呈正相关，而在本地队列中PIG13未见显著差异。

通过快速扩增cDNA末端（RACE）-PCR和测序技术确定PIG13-DT全长为1160个核苷酸，具有poly-A序列尾。在本地队列中，RT-qPCR分析显示PIG13-DT在HCC组织中的表达显著高于癌旁正常组织。TCGA数据库分析同样表明PIG13-DT在肿瘤组织中显著上调。相关性分析显示PIG13-DT水平与肿瘤分级、TNM分期和临床病理分期呈显著正相关。Kaplan-Meier分析显示高表达PIG13-DT患者（标准化计数>0.09）的总生存期较短。

LncRNA PIG13-DT过表达促进CSC功能并抑制ROS产生和凋亡

癌症干细胞（CSC）是肿瘤复发的主要贡献者，即使在治愈性治疗后也是如此。低氧和凋亡耐受都是HCC的标志性特征。研究人员在四种HCC细胞系（Hep3B、Huh7、SK-HEP-1和HepG2）中检测PIG13-DT的相对表达，发现其在所有细胞系中表达相对较低。选择Hep3B和Huh7细胞系进行后续研究。

使用shRNA载体实现PIG13-DT的稳定敲低（KD）和过表达（OE）后，球体形成实验表明PIG13-DT KD显著抑制球体形成效率，而PIG13-DT OE可逆转此效应。流式细胞术检测显示PIG13-DT KD显著增加ROS水平并促进HCC细胞凋亡，而PIG13-DT OE则呈现相反趋势。这些发现表明PIG13-DT可能显著增强CSC功能并抑制ROS产生和凋亡。

LncRNA PIG13-DT过表达促进增殖、迁移和侵袭能力

增殖和转移是恶性肿瘤的标志，驱动HCC的进展。功能实验评估细胞活力、增殖、迁移和侵袭表明，PIG13-DT KD细胞的细胞数量和活力显著降低，而PIG13-DT OE逆转此效应。Transwell迁移和侵袭实验显示PIG13-DT KD Hep3B和Huh7细胞的迁移和侵袭能力显著降低，而PIG13-DT OE细胞中则显著增强。这些结果证明PIG13-DT调控HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

LncRNA PIG13-DT通过直接结合并稳定YBX3蛋白促进HCC进展

LncRNAs可与RNA结合蛋白（RBP）相互作用，影响lncRNA和RBP的稳定性、RNA代谢和亚细胞定位，在调控癌症生物学中起关键作用。FISH测定显示PIG13-DT主要定位于细胞质。RNA pull-down assay和质谱分析发现了228个潜在相互作用蛋白。KEGG通路分析显示核糖体、剪接体和mRNA监视通路是最显著上调的通路，表明PIG13-DT可能在调控蛋白质翻译和RNA代谢中起重要作用。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析发现关键RBPs（包括YBX3蛋白）形成相互作用网络簇。这些RBPs显示出相对较高的信噪比（SNR）。免疫荧光实验和RNA免疫沉淀（RIP）-qPCR分析证明PIG13-DT和YBX3在HCC细胞质中共定位，且使用YBX3抗体成功pull down了PIG13-DT RNA。Western blot结果显示PIG13-DT KD细胞中YBX3水平显著降低，而PIG13-DT OE细胞中此效应被逆转，证明PIG13-DT/YBX3复合物稳定YBX3。

功能拯救实验显示，与PIG13-DT KD和载体对照组相比，PIG13-DT KD和YBX3 OE组的球体形成效率、凋亡、增殖和迁移能力得到恢复。这些结果验证了PIG13-DT通过直接与YBX3相互作用促进HCC进展，有助于稳定和增强其功能。

YBX3蛋白与USP15 mRNA相互作用增强其翻译

鉴于YBX3在RNA翻译和代谢调控中的参与，研究人员通过RNA-seq分析确定下游靶点。结果显示PIG13-DT KD细胞与对照组之间有4048个差异表达基因，KEGG分析显示PIG13-DT可调控AKT/mTOR和ERK/MAPK通路，并参与内吞作用和氧化磷酸化过程。GO分析显示这些下调基因中RNA结合功能下调最显著。

通过整合YBX3 eCLIP-seq数据、YBX3 RIP-seq数据和PIG13-DT KD RNA-seq数据，筛选出635个可能受PIG13-DT/YBX3复合物调控的mRNAs。KEGG通路分析显示这些mRNAs与多种信号通路相关。最终选择了六个有希望的候选基因，包括USP15、SMARCE1、DNM1L、TGFBR1、ITGB3BP和CUL1。RIP和RT-qPCR证明USP15、SMARCE1和DNM1L基因的内源性mRNA在HCC细胞中被YBX3特异性抗体成功富集。

基于YBX3 eCLIP-seq数据，YBX3可能直接结合USP15的3'UTR序列。双荧光素酶报告实验证明嵌合荧光素酶基因的荧光素酶活性被YBX3结合位点序列增强，进一步表明YBX3可结合USP15 mRNA以增强翻译。

LncRNA PIG13-DT通过稳定USP15 mRNA促进HCC进展

基于三个收敛标准选择USP15进行功能随访：其在HCC和其他恶性肿瘤中已有充分文献证明的促肿瘤作用；在PIG13-DT敲低RNA-seq数据中显著下调；通过独立RIP-qPCR和eCLIP-seq分析证实其与YBX3直接结合。

放线菌素D追踪实验评估PIG13-DT对USP15 mRNA稳定性的影响表明，PIG13-DT KD导致USP15 mRNA表达显著降低，而在PIG13-DT OE细胞中此效应被逆转。USP15 mRNA稳定性在PIG13-DT KD细胞中降低，而在PIG13-DT OE细胞中逆转。USP15蛋白在HCC细胞中也受PIG13-DT调控。

功能拯救实验证实PIG13-DT/YBX3/USP15轴对HCC进展的影响。球体形成、凋亡、细胞增殖和transwell迁移实验表明，USP15 OE组相比OE对照组这些功能得到恢复。Western blot分析显示PIG13-DT也可上调USP15信号相关蛋白（如NRF2和MDM2）的表达。这些结果证明PIG13-DT通过上调和稳定USP15 mRNA促进HCC进展。

PIG13-DT/YBX3/USP15轴在体内促进HCC进展

在BALB/c无胸腺裸鼠中建立皮下异种移植肿瘤模型验证lncRNA PIG13-DT的体内生物学功能。与阴性对照细胞相比，来自PIG13-DT KD Hep3B细胞的异种移植瘤的重量和体积显著减少。免疫组化显示PIG13-DT KD降低了异种移植瘤中YBX3和USP15的表达。

TCGA数据库预后相关性分析显示YBX3和USP15表达水平均与不良预后显著相关。TCGA和本地HCC队列中PIG13-DT、YBX3和USP15之间的相关性分析显示三者呈正相关。Western blot证实它们在HCC组织中上调。在10例lenvatinib治疗患者中，所有肿瘤都显示高PIG13-DT表达，但由于样本量有限，此观察是初步和假设生成的。

讨论

HCC是一种高度异质性恶性肿瘤，发病率和死亡率都很高。尽管诊断和治疗取得了进展，但不可切除HCC患者的预后仍然很差。阐明HCC进展的分子机制对于识别新的诊断生物标志物和治疗靶点至关重要。

本研究证明PIG13-DT在HCC组织中显著升高，其高表达与HCC患者不良预后相关，表明其可作为预测HCC患者预后的生物标志物。功能上，PIG13-DT过表达增强CSC功能，抑制ROS产生和凋亡，促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。PIG13-DT增强CSC功能可能有助于肿瘤复发和治疗抵抗，而抑制ROS和凋亡可能促进肿瘤生存和进展。

细胞质中的lncRNAs可作为RBP伙伴，介导信号转导通路、翻译程序和基因表达的转录后控制。本研究显示PIG13-DT主要定位于HCC细胞质中，直接与RNA结合蛋白YBX3相互作用，导致YBX3稳定性增加。鉴于YBX3蛋白在调控翻译和稳定性中的关键作用，研究人员提出PIG13-DT通过PIG13-DT/YBX3复合物调控翻译程序促进HCC进展。

通过整合三个组学数据集，发现USP15 mRNA是YBX3的重要靶标。证明PIG13-DT通过稳定USP15 mRNA促进HCC进展。USP15已被证明可促进肿瘤生长并抑制HCC细胞凋亡。USP15是多种癌症相关过程的关键调节因子，包括信号通路、凋亡、肿瘤免疫和囊泡运输。

体内实验进一步证实了PIG13-DT在HCC进展中的作用。PIG13-DT敲低导致体内YBX3和USP15蛋白表达降低，证明PIG13-DT/YBX3/USP15轴在HCC进展中的关键作用。TCGA和本地HCC队列中PIG13-DT、YBX3和USP15呈正相关。在一小部分lenvatinib治疗的HCC患者中，PIG13-DT高表达肿瘤似乎表现出较差的反应趋势，但此观察是初步的，需要在更大规模的研究中验证。

材料与方法

临床标本收集

从中山大学附属第一医院普外科接受PD-1（PLH）治疗的患者中收集人HCC配对肿瘤和癌旁非肿瘤组织样本。为进一步阐明PIG13-DT/YBX3/USP15轴在HCC中的作用，从中山大学附属第一医院获得10例接受lenvatinib治疗的HCC患者的配对肿瘤和正常组织样本。所有参与者均获得书面知情同意。从TCGA数据库下载临床样本进行lncRNA和mRNA表达分析。

细胞培养

人HCC细胞系（包括Hep3B、Huh7、SK-HEP-1和HepG2）来源于上海中国科学院细胞库。这些细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中维持，在37°C、5% CO₂湿润环境中培养。

细胞源性异种移植（CDX）

实验符合动物福利和3R（替代、减少、优化）原则，经Genechem机构动物护理和使用委员会批准（批准号：GSGC0198074）。20只雌性BALB/c裸鼠（4周龄，平均体重：13克）分为PIG13-DT敲低（KD）组和KD对照（Ctrl）组。将人Hep3B细胞以4×10⁶密度显微注射到小鼠右肢侧腹。移植后第22、25、28、31和33天测量肿瘤大小。第33天处死所有小鼠，收集肿瘤并称重。

分子生物学实验

使用TRIzol Plus RNA纯化试剂盒提取总RNA。使用GeneRacer?试剂盒进行5'和3' RACE实验。使用shRNA载体构建PIG13-DT敲低和过表达慢病毒。通过RT-qPCR技术验证稳定细胞系。使用SYBR Premix Ex Taq II在LightCycler系统上进行RT-qPCR。

功能实验

球体形成实验使用超低附着板培养细胞10-14天。ROS检测使用DCFH-DA染色并通过流式细胞术分析。细胞凋亡使用Annexin V-APC和/或PI染色通过流式细胞术评估。细胞增殖使用MTT assay检测。细胞迁移和侵袭使用Transwell实验评估。

分子相互作用研究

FISH实验使用Cy3标记的RNA探针检测PIG13-DT亚细胞定位。RNA pull-down实验使用生物素标记的PIG13-DT转录本。质谱分析鉴定相互作用蛋白。RIP实验使用YBX3抗体沉淀复合物。双荧光素酶报告实验评估YBX3介导的翻译增强。

数据分析

使用SPSS 19.0软件进行统计分析。临床病例数据比较使用Mann-Whitney U检验。生存分析使用Kaplan-Meier法。相关性分析使用Spearman等级相关系数。组间显著差异使用Student t检验确定，P值<0.05视为 statistically significant。所有实验至少独立进行三次以确保结果的可重复性和可靠性。