Parishin通过调控ACSL4/p-Smad3/PGC-1α通路保护脓毒症诱导的肠道损伤：生物信息学与实验验证的整合研究

《Journal of Inflammation Research》：Parishin Protects Against Sepsis-Induced Intestinal Injury by Modulating the ACSL4/p-Smad3/PGC-1α Pathway: An Integrated Approach of Bioinformatics and Experimental Validation

本研究通过整合生物信息学分析与实验验证，揭示了传统中药活性成分Parishin通过靶向长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4），抑制Smad3磷酸化（p-Smad3），上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α（PGC-1α）表达，从而改善线粒体功能、抑制铁死亡（Ferroptosis），最终减轻脓毒症（Sepsis）诱导的肠道损伤并提高生存率，为脓毒症肠道屏障功能障碍提供了新的治疗靶点和策略。

　　

摘要

脓毒症是一种危及生命的临床综合征，其高死亡率与多器官功能障碍密切相关，其中胃肠道被认为是多器官功能障碍综合征的“启动器官”。本研究旨在探讨长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）在脓毒症肠道损伤中的作用及其潜在治疗靶点。

背景

脓毒症是全球范围内导致死亡的主要原因之一，重症监护病房患者的死亡率高达25%-40%。肠道在脓毒症病理生理过程中扮演着核心角色，其屏障功能的破坏会导致细菌和内毒素易位，进而引发全身性炎症反应和多器官功能障碍。铁死亡是一种铁依赖性的、以脂质过氧化为特征的调节性细胞死亡形式，其在脓毒症器官损伤中的作用日益受到关注。ACSL4作为脂质代谢和铁死亡的关键调节因子，可能成为脓毒症肠道损伤的潜在治疗靶点。Parishin是一种来源于天麻的酚苷类化合物，具有抗炎、抗氧化等药理活性，但其对脓毒症肠道损伤的保护作用及机制尚未明确。

方法

本研究整合了生物信息学分析和实验验证。首先，从GEO数据库获取多个脓毒症相关基因表达数据集，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建，筛选出与脓毒症诊断和功能模块相关的核心基因。利用分子对接技术从天然产物库中筛选与ACSL4具有高结合亲和力的化合物。随后，通过盲肠结扎穿刺（CLP）法构建小鼠脓毒症模型，并在体内外验证Parishin的治疗效果及作用机制。实验指标包括炎症因子水平、肠道屏障功能、铁死亡相关标志物、线粒体功能以及动物生存率等。

结果

生物信息学分析发现，ACSL4是五个独立数据集中共同显著上调的基因，且在PPI网络中具有高度连通性。ROC曲线分析显示ACSL4对脓毒症具有较高的诊断价值（AUC = 0.924）。分子对接结果表明，Parishin与ACSL4具有最强的结合亲和力（对接得分：-17.701）。在脓毒症动物模型中，ACSL4在血浆单核细胞和肠道组织中表达显著上调，伴随炎症细胞因子、脂质过氧化（LPO）、丙二醛（MDA）和Fe²⁺水平升高，铁死亡相关蛋白表达也明显增加。Parishin治疗显著改善了这些病理变化，降低了铁死亡相关标志物，提高了脓毒症小鼠的72小时生存率。机制上，Parishin通过下调ACSL4表达，抑制Smad3磷酸化，进而促进PGC-1α表达，改善线粒体功能，最终抑制铁死亡和保护肠道屏障。

结论

Parishin通过调控ACSL4/p-Smad3/PGC-1α通路，改善线粒体功能，抑制铁死亡，从而减轻脓毒症诱导的肠道损伤。本研究不仅揭示了ACSL4在脓毒症肠道损伤中的关键作用，也为Parishin作为潜在治疗药物提供了实验依据。

引言

脓毒症是由感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，全球每年有近5000万人受影响，并导致约1100万死亡。尽管重症监护技术不断进步，脓毒症仍是危重患者死亡的主要原因。胃肠道是脓毒症中最易受累的器官之一，并在多器官功能障碍综合征的发生发展中起核心作用。肠道上皮屏障的破坏导致病原体和毒素易位至全身循环，激活远处器官的免疫细胞并扰乱免疫稳态。因此，针对肠道屏障功能的靶向治疗策略对于改善脓毒症预后具有重要意义。

铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，其在脓毒症相关器官损伤中的作用逐渐被揭示。ACSL4作为脂肪酸代谢的关键酶，通过促进多不饱和脂肪酸掺入膜磷脂，在铁死亡中发挥重要作用。本研究通过生物信息学分析发现ACSL4是脓毒症的关键差异表达基因，并进一步通过网络药理学筛选出其潜在抑制剂Parishin。Parishin是天麻的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。本研究旨在探讨Parishin是否通过调控ACSL4及相关通路对脓毒症肠道损伤发挥保护作用。

材料与方法

数据收集与处理

从NCBI GEO数据库获取基因表达谱数据，包括GSE28750、GSE57065、GSE65682、GSE69528、GSE8121和GSE95233（验证集）。使用WGCNA包进行异常样本和基因过滤，鉴定差异表达基因（DEGs），并通过DAVID进行基因本体（GO）富集分析，利用KEGG数据库进行通路富集分析。

WGCNA

WGCNA用于识别基因共表达模块，并将模块与临床性状（脓毒症）关联。通过构建基因共表达网络，将基因聚类为模块，并筛选与脓毒症最相关的模块及其核心基因。

PPI网络构建

基于DEGs构建PPI网络，通过拓扑网络分析筛选关键枢纽基因。使用Cytoscape可视化网络，节点大小和颜色强度反映基因连通性。

ROC曲线分析

使用pROC包进行ROC曲线分析，评估候选基因的诊断性能，计算曲线下面积（AUC）以量化诊断准确性。

分子对接

从DrugBank数据库筛选符合Lipinski五规则的化合物，以ACSL4为靶蛋白进行分子对接。使用Schr?dinger Maestro进行对接，PyMol进行三维可视化。通过Virtual Screening Workflow模块进行高通量虚拟筛选，Glide模块完成对接。

动物模型

使用8周龄雄性C57BL/6小鼠，通过CLP法建立脓毒症模型。假手术组仅开腹，不进行结扎穿刺。Parishin治疗组在术前1小时腹腔注射Parishin（50 mg/kg）。术后监测平均动脉压，成功诱导脓毒症的标准为基线值降低≥30%。所有动物在CLP后24小时处死，收集组织和血液样本。

细胞培养

IEC-6细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中。实验分为对照组（无血清DMEM培养12小时）、脓毒症组（10 μg/mL LPS处理）和治疗组（LPS处理后加入20、50、100、200 μmol/L Parishin培养12小时）。外周血单核细胞通过密度梯度离心法分离。

组织学检查

肠道组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行HE染色和透射电镜（TEM）观察超微结构变化。

Western blot

提取组织或细胞总蛋白，BCA法测定浓度，SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，封闭后孵育一抗和二抗，Odyssey CLx成像系统检测信号。

免疫荧光

细胞固定、透化后，封闭，孵育ZO-1一抗和荧光二抗，DAPI复染核，激光共聚焦显微镜观察。

脂质ROS检测

流式细胞术检测脂质ROS水平，使用BODIPY^TM 581/591 C11探针，488 nm激发，501-563 nm发射检测。

线粒体呼吸功能

使用Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒评估线粒体呼吸功能。

生存分析

每组16只小鼠，记录CLP后72小时内生存率和生存时间，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验比较组间差异。

统计学分析

使用R软件进行统计分析。正态分布数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或Tukey多重比较检验；非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验。P < 0.05认为差异有统计学意义。

结果

差异表达基因鉴定

从五个数据集中共鉴定出159个共同差异表达基因。火山图和维恩图显示这些基因在脓毒症患者中一致失调。

GO和KEGG富集分析

GO分析显示，上调基因主要富集于自噬、吞噬小体组装等过程，下调基因富集于泛素样蛋白修饰、炎症小体活性等通路。KEGG分析表明，DEGs显著富集于免疫相关通路，特别是中性粒细胞活化和功能障碍。

WGCNA

样本聚类树状图显示无显著异常样本。模块-性状关系热图显示每个数据集中有一个模块与脓毒症显著相关。交叉分析鉴定出五个重叠的核心基因：ACSL4、IL13RA1、MARCKS、NUMB和RNF19B，其中ACSL4的基因显著性最高。

PPI网络与枢纽基因

基于159个DEGs构建PPI网络，筛选出前30个枢纽基因。与DEGs交集后发现ACSL4是唯一重叠基因。

ACSL4表达验证

在独立数据集GSE95233中，ACSL4在脓毒症患者中表达显著上调，ROC曲线分析AUC为0.924，表明其具有良好的诊断性能。

分子对接

从两个天然产物库中筛选出500个化合物进行分子对接，Parishin（HY-N2031）与小鼠ACSL4蛋白结合最强，形成12个氢键和1个π-阳离子相互作用。

Parishin的治疗效果

Parishin显著下调单核细胞和肠道上皮细胞中ACSL4的mRNA表达。改善肠道屏障功能，降低血浆DAO、D-乳酸和LPS水平。组织学显示Parishin减轻肠道黏膜损伤和炎症细胞浸润，TEM显示部分恢复线粒体形态和上皮完整性。Parishin降低血浆TNF-α、IL-1β和IL-6水平，显著提高脓毒症小鼠72小时生存率。细胞实验表明Parishin促进IEC-6细胞增殖，恢复ZO-1蛋白表达。

Parishin抑制铁死亡

普鲁士蓝染色显示Parishin减少肠道组织铁沉积。体外实验表明Parishin降低LPS诱导的MDA和Fe²⁺水平，减少铁积累和脂质过氧化。Western blot显示Parishin上调GPX4和SLC7A11表达，下调COX2表达。

Parishin改善线粒体功能

Parishin上调PGC-1α表达，下调ACSL4和p-Smad3水平。沉默ACSL4后，p-Smad3表达降低，PGC-1α表达增加。共聚焦显微镜显示Parishin改善线粒体膜电位，降低线粒体ROS水平。Seahorse分析表明Parishin增强基础和高最大线粒体呼吸。

讨论

脓毒症的免疫失调和器官功能障碍仍是临床难题。本研究通过整合生物信息学与实验验证，将ACSL4确立为脓毒症肠道损伤的关键分子。ACSL4通过促进脂质过氧化参与铁死亡，其表达上调与脓毒症严重程度相关。Parishin作为ACSL4的有效抑制剂，通过调控ACSL4/p-Smad3/PGC-1α轴，改善线粒体功能，抑制铁死亡，从而保护肠道屏障。此外，Parishin还可能通过Nrf2/HO-1、NF-κB等通路发挥抗炎和抗氧化作用。然而，本研究存在一定局限性，如未能全面评估Parishin对其他器官的影响及其在脓毒症后期免疫抑制阶段的作用。未来研究需进一步明确Parishin的临床适用性和长期疗效。

结论

本研究证实ACSL4是脓毒症肠道损伤的重要生物标志物和治疗靶点。Parishin通过调控ACSL4/p-Smad3/PGC-1α通路，改善线粒体功能，抑制铁死亡，减轻肠道损伤并提高生存率。这些发现为脓毒症提供了新的治疗策略，并凸显了传统中药活性成分的临床转化潜力。