焦亡相关基因作为脓毒症诱导ARDS预后生物标志物及免疫浸润特征的单细胞与批量RNA测序分析

《Journal of Inflammation Research》：Pyroptosis-Related Genes as Prognostic Biomarkers and Immune Infiltration Features in Sepsis-Induced ARDS: A Single-Cell and Bulk RNA-Sequencing Analysis

本研究通过整合单细胞RNA测序和批量转录组数据分析，系统探讨了焦亡相关基因（PRGs）在脓毒症诱导急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的预后价值及免疫调控机制。研究构建了基于四个关键基因（CCL5、CD3G、IL7R、GIMAP4）的预后模型，揭示其与CD8+T细胞等免疫细胞浸润的显著关联，为脓毒症ARDS的临床分层诊疗提供了新型分子靶点。

　　

摘要

脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种常见且治疗成本高昂的综合征，具有高死亡率和缺乏靶向治疗的特点。焦亡（pyroptosis）作为一种程序性细胞死亡的炎症形式，其相关基因（PRGs）在脓毒症诱导的ARDS中的表达及其与预后的关系尚不清楚。本研究分析了来自公共数据集的760个脓毒症样本。首先对基因表达综合数据库（GEO）中的脓毒症单细胞RNA测序数据进行了全面分析，识别出8种细胞类型和38个枢纽基因。随后，采用单变量Cox风险分析筛选候选基因，并利用疾病队列开发预后模型，将患者分为高风险和低风险组。最终鉴定出四个与入住重症监护室≥28天的脓毒症患者预后相关的基因。高风险患者的活化CD8⁺T细胞、效应记忆CD8⁺T细胞和记忆B细胞比例较低。大多数免疫细胞彼此呈正相关，但中性粒细胞与其他因素呈负相关。重要的是，预后基因与相应免疫细胞的相关性分析显示，CCL5、CD3G和IL7R与活化CD8⁺T细胞显著相关，而GIMAP4与多种免疫细胞呈显著负相关。多变量分析确定风险评分是一个独立的预后因素。PRGs在脓毒症免疫中扮演重要角色，上述四个关键基因（CCL5、CD3G、IL7R和GIMAP4）有望作为临床诊断靶点，为脓毒症诱导的ARDS患者的临床预后分层提供依据，并指导个体化治疗策略的制定。

引言

脓毒症是一种严重的感染性疾病，以危及生命的器官功能障碍和高死亡率为特征。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的致命性疾病，其特征是严重的低氧性肺衰竭，需要机械通气。严重脓毒症占ARDS所有致病因素的最高比例，是一个重要的风险因素。研究表明，脓毒症诱导的ARDS患者比非脓毒症相关的ARDS患者具有更高的死亡率和更差的结局。由于高死亡率和预后异质性，脓毒症诱导的ARDS迫切需要可靠的预后生物标志物。焦亡是一种独特的程序性细胞死亡形式，通过基因控制的细胞破坏引发炎症反应，其特征是细胞肿胀、膜气球样变、裂解和促炎细胞内容物的释放等形态学变化。该过程受焦亡相关基因（PRGs）的调控。焦亡不仅是先天免疫系统炎症反应的重要贡献者，作为对感染的反应导致组织损伤，而且在清除病原体和内源性风险信号中起着至关重要的作用。因此，焦亡是一把“双刃剑”。在脓毒症诱导的急性肺损伤中，抑制焦亡的研究得到了抑制C3A-C3AR补体轴和NLRP3有效性的支持。理解如何平衡双向效应可能有助于解释脓毒症诱导的ARDS或焦亡的进展。第二代高通量RNA测序（RNA-Seq）是一种无偏倚的方法，用于研究不同疾病状态或不同治疗条件下的转录组变化。为了更深入地了解与败血症相关的遗传事件并阐明其炎症病因，本研究旨在通过生物信息学分析，利用GEO数据识别脓毒症中的差异表达基因（DEGs）。

材料与方法

本研究主要依赖于公开可用数据，主要来源是GEO数据库。通过R包“GEOquery”从GEO数据库获取脓毒症的全基因组表达谱。GSE65682数据集包含760个脓毒症患者样本和42个正常对照样本，使用Affymetrix GPL13667 [HG-U219]人类基因组U219芯片平台获得。从GEO数据库的大量单细胞测序数据中，识别出一个包含四个非复杂性脓毒症样本和三个脓毒症诱导的ARDS相关样本的数据集。使用Seurat R软件包（版本4.2.0）处理GSE151263的单细胞原始数据。经过初步质量控制评估和去除双细胞后，20369个细胞用于单细胞转录组分析。采用“AUCell” R包中的基因集富集分析（GSEA）对每个细胞中的通路进行评分。基于73个选定的焦亡基因的曲线下面积（AUC）值，为每个细胞构建基因表达排名，以评估基因集在每个细胞中高度富集的比例。从大量文献来源获得了与焦亡相关的基因列表。使用“AUCell_exploreThresholds”函数确定识别基因集中活性细胞的阈值。利用Monocle 2进行伪时间分析，基于用户定义的基因列表生成伪时间图，以适应表现分支和线性模式组合的分化过程。使用“CellChat” R包进行细胞通讯分析，考虑对照组和脓毒症组的唯一分子标识符（UMI）计数矩阵。使用“CellChatDB.human”配体-受体相互作用数据库。使用“clusterProfiler” R包（版本4.2.2）对显著DEGs进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。采用单变量Cox风险分析评估焦亡相关的DEGs的预测意义及其与疾病队列28天生存率的关系。使用R包“glmnet”进行最小绝对收缩和选择算子（LASSO）Cox回归模型，缩小潜在基因列表并生成预测模型。使用中位风险评分将训练队列分为低风险和高风险亚组。采用Kaplan-Meier分析进行预后目的，并使用Log rank检验显著性。使用受试者工作特征（ROC）曲线评估预测模型的效率。利用单样本GSEA（ssGSEA）量化28种免疫细胞类型的相对富集分数。使用GSE69528数据集作为外部验证。

结果

单细胞测序分析

对脓毒症和脓毒症ARDS细胞群的分析显示，细胞在脓毒症组和对照组中均匀分布。细胞被分为12个簇，并利用细胞类型特异性生物标志物标记了8种细胞类别：CD4⁺T细胞、CD14⁺单核细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞、单核细胞来源的树突状细胞（Mo-DC）、CD16⁺单核细胞和巨核细胞祖细胞。分析样本中CD4⁺T细胞、CD14⁺单核细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞普遍存在。

焦亡活性细胞的伪时间分析

使用优选阈值检测到197个发生焦亡的活性细胞。AUC值 > 0.18的细胞群体表现出高焦亡活性，而AUC值 < 0.18的细胞群体活性较低。利用明确的高焦亡活性细胞构建转录轨迹，以识别控制脓毒症进展的关键基因表达程序。轨迹的初始段包含NK和CD8⁺T细胞，而终点由CD14⁺单核细胞占据，从CD4⁺T细胞过渡。每个状态中的主要细胞类型是NK细胞、CD4⁺T细胞和CD14⁺单核细胞。

脓毒症微环境中的细胞通讯模式

细胞通讯网络分析显示，与对照组相比，ARDS组织中的细胞相互作用数量和强度均有所减少。比较对照组和脓毒症-ARDS组织之间的信号模式发现，例如，作用于NK细胞的MHC-I信号强度在ARDS中增强。CD8⁺T细胞主要通过MIF和MHC-I途径与NK细胞相互作用，这种相互作用在ARDS中增加。

脓毒症中焦亡相关DEGs的富集分析

在单细胞RNA数据集中，比较脓毒症和脓毒症相关ARDS样本，识别出290个具有统计学显著差异的基因（DEG1）。在批量转录组数据集中，比较脓毒症组和正常组，识别出1404个具有统计学显著差异的基因（DEG2）。比较焦亡活性和非活性细胞之间的基因，识别出605个具有统计学显著差异的基因（DEG3）。三个DEGs集的交集产生了38个枢纽基因。GO富集分析显示，这些基因参与多种生物过程（BP），包括“树突状细胞抗原加工和呈递”、“T细胞分化”和“淋巴细胞分化”；细胞成分（CC）如“网格蛋白包被的内吞囊泡膜”、“网格蛋白包被的内吞囊泡”、“网格蛋白包被的囊泡膜”；分子功能（MF）如“肽酶调节剂活性”、“蛋白质结合”、“半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性”。

预后风险模型的构建与验证

对38个枢纽基因进行单变量cox分析，识别出10个与脓毒症预后相关的基因。LASSO回归分析最终确定了四个与入住ICU≥28天的脓毒症患者28天预后相关的基因。根据中位风险值将样本分为高风险和低风险组。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，在所有队列中，高风险组的预后明显差于低风险组。训练队列的5天、10天和15天生存率的ROC值分别为0.792、0.777和0.738；验证队列的ROC值分别为0.807、0.748和0.752。

预后基因在不同细胞簇中的表达

预后基因在大多数细胞类型中表达水平较低。具体而言，IL7R在CD4⁺T细胞中高表达，而CCL5在CD8⁺T细胞、NK细胞和巨核细胞祖细胞中高表达。GSEA识别出最显著富集的通路，包括“淀粉和蔗糖代谢”、“心肌收缩”、“JAK STAT信号通路”、“I型糖尿病”、“移植物抗宿主病”和“抗原加工和呈递”。GSVA分析显示，低风险组富集了免疫相关通路，包括T细胞受体信号通路、NOTCH信号通路和一些免疫相关疾病。

免疫浸润

ssGSEA用于测量高风险和低风险人群中28种免疫细胞类型的浸润水平。高风险患者的特点是活化树突状细胞、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、中央记忆CD4⁺T细胞、中央记忆CD8⁺T细胞、效应记忆CD4⁺T细胞、γδ T细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、NK细胞、浆细胞样树突状细胞、调节性T细胞、滤泡辅助T细胞、1型辅助T细胞和17型辅助T细胞的比例增加，同时活化CD8⁺T细胞、效应记忆CD8⁺T细胞和记忆B细胞的比例减少。大多数免疫细胞群体彼此相关，但中性粒细胞与其他免疫细胞呈负相关。预后基因与相应免疫细胞的相关性分析显示，CCL5、CD3G和IL7R与活化CD8⁺T细胞显著正相关；CD3G与效应记忆CD8⁺T细胞正相关；GIMAP4与活化树突状细胞、CD56^bright NK细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞等免疫细胞呈显著负相关。

列线图的构建与验证

单变量Cox回归分析显示，风险评分是独立的预后风险因素。基于多变量Cox回归分析构建的列线图显示风险评分对临床结局具有显著的预测能力。5天、10天和15天生存预测的校准曲线与实际结果一致。列线图预测患者预后的ROC曲线分析显示，5天、10天和15天生存率的AUC值分别为0.815、0.790和0.752。

预后模型对脓毒症的预测验证

基于风险评分和预后基因在脓毒症数据集中的表达进行ROC曲线分析，结果显示风险评分和预后基因作为诊断依据具有良好的预测准确性（AUC > 0.9）。在独立数据集GSE69528中进一步验证了风险评分和各个基因的诊断效率，风险评分、IL7R、CD3G和CCL5的AUC值均大于0.7，表明它们均具有良好的诊断价值。

讨论

脓毒症是一种危重且危及生命的疾病，是ARDS的主要诱因，源于宿主对感染失控的反应。由于脓毒症的异质性和缺乏靶向治疗，患者常迅速进展为ARDS，导致预后不良和高死亡率。免疫细胞浸润对脓毒症的发展至关重要。识别不同的预后标志物并 scrutinizing 脓毒症中的免疫细胞浸润模式对于改善该病患者的预后至关重要。

单细胞测序分析揭示了脓毒症微环境中的细胞异质性，并识别出高焦亡活性的细胞群体。细胞通讯分析强调了MHC-I和MIF信号在NK细胞与CD8⁺T细胞相互作用中的重要性，表明它们在脓毒症诱导的ARDS发病机制中的促炎作用。研究构建的四个基因（CCL5、CD3G、IL7R、GIMAP4）预后模型能有效区分脓毒症患者的预后风险。免疫浸润分析揭示了高风险患者独特的免疫特征，特别是与CD8⁺T细胞和B细胞亚群相关的改变。这些基因不仅与预后相关，而且与特定的免疫细胞浸润水平显著相关，提示焦亡过程与免疫调节在脓毒症诱导的ARDS中存在密切联系。

研究的局限性包括单细胞测序样本量较小、结论主要基于生物信息学分析缺乏实验验证、以及可能未完全解释临床异质性。未来的研究需要在更多多中心、大规模前瞻性临床样本中进行验证，并结合体外和体内功能实验，深入探索关键基因在疾病发生发展中的功能机制作用。

结论

本研究提出了一个预测脓毒症诱导的ARDS患者预后的开创性基因特征，为未来探究脓毒症诱导的ARDS中免疫反应与PRGs之间的联系奠定了重要基础。