青蒿提取物通过MAPK通路改善特应性皮炎：基于3D表皮模型及体外实验的证据

《Journal of Experimental Pharmacology》：Artemisia annua Extract Ameliorates Atopic Dermatitis: Evidence from 3D Epidermal Model and Complementary in vitro Assays

本研究通过3D表皮模型和体外实验证实，青蒿提取物（AAE）可显著改善特应性皮炎（AD）样模型的皮肤屏障功能（如促进丝聚蛋白FLG、兜甲蛋白LOR表达）并抑制炎症反应（如降低TSLP、IL-6等细胞因子），其作用机制与抑制MAPK信号通路过度激活相关，为天然产物治疗AD提供了新策略。

　　

Abstract

Background

特应性皮炎（AD）是一种慢性复发性炎症性皮肤病，表皮屏障破坏和炎症反应是该病发生发展的关键因素。青蒿提取物（AAE）作为广泛使用的中药，具有抗炎特性，可能有益于AD的管理。

Objective

旨在评估AAE在AD样三维（3D）表皮等效模型中抑制炎症和促进皮肤屏障修复的能力。

Methods

采用Cell Counting Kit-8评估AAE三种浓度（0.1%、0.3%和1%）对角质形成细胞的细胞毒性。使用甲基-β-环糊精（MβCD）及白细胞介素（IL）-4、IL-13和IL-25诱导AD样模型。比较AAE处理的AD模型、未处理AD模型和正常对照模型之间皮肤结构蛋白表达、炎症因子及组织病理学表现。

Results

1% AAE能显著恢复皮肤屏障蛋白丝聚蛋白（FLG）（p < 0.0001）、兜甲蛋白（LOR）（p < 0.0001）和桥粒芯蛋白-1（DSG1）（p < 0.05）的表达，同时显著降低HAS3（p < 0.05）、NELL2（p < 0.0001）、TSLP（p < 0.01）以及IL-1α（p < 0.001）、IL-6（p < 0.01）和IL-8（p < 0.0001）的表达。AAE可能通过抑制AD样3D表皮模型中MAPK通路的过度激活发挥其作用。

Conclusion

1% AAE在AD样3D表皮等效模型中能抑制炎症并促进皮肤屏障功能。AAE主要包含Arteannuin B、绿原酸、Chrysoplenol D、Scopolin和Vitexicarpin，被确定为AD治疗的潜在靶点。

Introduction

AD由遗传倾向和环境因素引起，与皮肤屏障功能障碍和免疫系统失衡相关。其发病机制复杂，皮肤屏障缺陷和辅助性T细胞2型（Th2）免疫应答下调是关键因素。角质形成细胞在表皮中扮演屏障角色，并参与皮肤免疫应答。表皮蛋白如FLG、LOR等表达下降会导致屏障功能障碍。Th2细胞因子刺激会增加AD相关基因如NELL2和HAS3的表达。激活的角质形成细胞释放TSLP、IL-1α等促炎细胞因子，进一步加剧免疫反应。青蒿（Artemisia annua）作为传统中药，具有抗炎、免疫调节等活性。本研究旨在探讨AAE对AD样模型的影响及其机制。

Materials and Methods

The Preparation of AAE

青蒿地上部分干燥后用水回流提取，浓缩后加乙醇至终浓度70%除杂，冻干得AAE。

Target Identification, GO and KEGG Pathway Enrichment Analyses

通过Swiss Target Prediction和GeneCards数据库预测AAE成分的靶点，并进行GO和KEGG富集分析。结果显示AAE可能通过MAPK、NF-κB、PI3K-AKT等信号通路发挥作用。

Cell Culture and Cell Cytotoxicity Assay

角质形成细胞培养于KcGrowth培养基。CCK-8法检测AAE浓度0.03%-3%的细胞毒性，确定0.1%-1%为安全浓度用于后续实验。

Construction of AD-Like 3D Epidermal Model

3D表皮模型（EpiKutis）用MβCD/IL-mix（MβCD 3.75 mM, IL-4 50 ng/mL, IL-13 50 ng/mL, IL-25 20 ng/mL）诱导AD样模型，并加入不同浓度AAE处理。

Histopathology

模型切片进行苏木精-伊红（HE）和FLG免疫组化染色。

Analysis of mRNA Expression by qPCR

TRIzol法提取总RNA，反转录为cDNA，qPCR检测FLG、LOR、DSG1、HAS3、NELL2等基因表达。

Analysis of Cytokine Arrays by ELISA

收集培养上清，ELISA检测TSLP、IL-1α、IL-6、IL-8等细胞因子水平。

Western Blots

蛋白样品通过SDS-PAGE分离，转膜后使用FLG、TSLP、p38 MAPK、p-p38 MAPK等抗体进行Western blot分析。

Proteome and Transcriptome Sequencing

对对照组、AD样组及AAE处理组进行蛋白质组和转录组测序，分析差异表达基因和通路。

Bioinformatic Analysis

使用Cluster 3.0、Java Treeview、CELLO、InterProScan、KEGG等工具进行生物信息学分析。

Statistical Analysis

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey多重比较，p < 0.05为显著差异。

Results

GO and KEGG Pathway Enrichment Analyses of the Putative Targets of AAE for AD Therapeutics

GO分析显示AAE涉及炎症反应调控、蛋白质处理、糖皮质激素应答等生物过程。KEGG分析提示MAPK、PI3K-AKT、NF-κB等通路富集。

Effect of AAE on Keratinocytes Proliferation in vitro

AAE在0.1%-1%浓度下对角质形成细胞无显著毒性，细胞活力与对照组无差异。

MβCD/IL-Mix Induced AD-Like 3D Epidermal Model

MβCD/IL-mix诱导的模型出现角化过度、海绵层水肿等AD样病理改变，FLG表达下降，NELL2、TSLP、IL-1α等表达上升。

AAE Repairs Abnormal Phenotypes in the MβCD/IL-Mix-Induced AD-Like 3D Epidermal Model

AAE处理组海绵层水肿减轻，角质透明颗粒增多，FLG表达回升。qPCR显示AAE剂量依赖性上调FLG、LOR、DSG1 mRNA，下调HAS3、NELL2 mRNA。Western blot证实1% AAE显著提升FLG蛋白表达。

AAE Inhibited the Transcriptional Regulation of MAPK Signal Pathway

ELISA和Western blot显示AAE降低TSLP、IL-1α、IL-6、IL-8等细胞因子水平。蛋白质组/转录组测序及Western blot表明AAE抑制p38 MAPK磷酸化，提示其通过调控MAPK信号通路缓解AD样症状。

Discussion

AD病程长、易复发，现有治疗存在局限。天然产物如AAE因副作用小受到关注。本研究利用3D表皮模型模拟AD，证实AAE能改善屏障功能、抑制炎症，机制与MAPK通路抑制相关。AAE中活性成分如绿原酸、Scopolin等可能协同作用。但研究限于体外模型，未来需动物实验验证。

Conclusion

AAE通过修复皮肤屏障蛋白（FLG、LOR、DSG1）和抑制促炎因子（TSLP、IL-1α、IL-6、IL-8）表达，有效改善AD样表型，其作用与MAPK通路调控密切相关。AAE成为AD治疗的潜在天然药物候选。

Abbreviations

AD（特应性皮炎）、Th2（辅助性T细胞2型）、AAE（青蒿提取物）、3D（三维）、MβCD（甲基-β-环糊精）、IL（白细胞介素）、FLG（丝聚蛋白）、LOR（兜甲蛋白）、DSG1（桥粒芯蛋白-1）、HAS3（透明质酸合酶3）、NELL2（神经表皮生长因子样蛋白2）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、TSLP（胸腺基质淋巴细胞生成素）、qPCR（实时定量PCR）、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）、DMSO（二甲基亚砜）、CI（置信区间）。